物种起源的识别具有的服装MALDI-ToF质谱使用头发胰蛋白酶的消化

Klaus Hollemeyer^一个沃尔夫冈•Altmeyer^b埃尔Heinzle^一个和基督教皮特拉^c

^一个萨尔州大学生物化学工程学院校园,d - 66123 Saarbruecken,德国
^bGene-Facts GbR科技园1 Stuhlsatzenhausweg 67 d - 66123 Saarbruecken,德国
^c动物园和野生动物研究所,Postfach 601103 d - 10252柏林,德国

介绍

我们在2007年推出了我们的方法半岛综合体育官方APP下载德甲光谱学欧洲bdapp官方下载安卓版¹描述基于识别的皮草头发消化matrix-assisted激光解吸/电离飞行时间(MALDI-ToF)质谱(MS)。结果表明,所谓的暹罗(物种识别动物的)方法是一种可靠的专门哺乳动物物种鉴定的蛋白质技术。除了识别可疑皮草的EU-ban国内猫狗皮毛贸易,从2009年1月进入作为进一步和/或类似的动物保护法律、质量检查动物的头发派生的高价格的衣服经常执行。物种归属不明的毛皮或羊毛考古样品是这一主题的一个新的应用程序。考古头发样本的识别是很难使用显微镜等经典方法和/或聚合酶链反应技术(PCR)。经常史前的层外表面受损头发(epi -和外角皮)是由于物理、化学和/或微生物的影响特别是在理想条件下储存。这些缺点使微小的决定通常是不确定的。虽然有例子以不稳定的部分幸存的古代DNA的头发样本,对于PCR鉴定技术,这个nucleotide-based方法经常失败,因为其余严重受损的DNA。负责这是上面提到的相同的效果,而真菌攻击头发甚至可能导致疲惫的贝壳,形容为“幽灵纤维”。²

头发角质蛋白分子的结构基础比DNA对这些环境压力因素和可能是守恒的小理想条件下化学退化甚至数千年。因此古代皮草的物种的决心是一个新的挑战暹罗的方法来演示其性能和添加更多的应用领域。

世界著名的具有(奥兹冰人)妈妈

1991年男性人类木乃伊尸体被发现在他周围一个提洛尔人的冰川与他所有的装备。他没有埋,但死于暴力。³偶然的机会他被保存在冰和释放在经过5300年的独特见证铜石并用时代的时代,最后Neolithicum的时期。,他被称为具有在公开场合,给机会有一个视图到日常生活Neolithicum年末揭示医疗条件的身体,他的营养状态和技术状态的艺术。机械技能和植物学知识研究以及他的衣服的质量和来源。没有发现纺织品但独家皮革和毛皮衣服。回答他的社会预期的社会文化状态的物种鉴定他的衣服。⁴的专门寻找野生动物是他的皮革和毛皮配备的起源就有可能,他的社会没有驯化物种因此属于更原始的狩猎者和采集者社会。然而,识别主要的驯化物种起源的他的衣服,更进步agro-pastoral经济支持。

巨大的年龄,认为改变存储条件下,意味着微观决定和PCR鉴定工作的头发和毛皮导致不确定的识别结果。因此,四个样品他的衣服,他的两个外套(Ha 43/91/130和Ha 6/91)一个样品从他的紧身裤(5/91公顷)和一个来自他的鞋子使用暹罗(Ha 2/91)研究了物种鉴定的方法。⁵

SIAM-method描述

减少国际米兰后,分子内二硫桥,没有任何清理和/或浓缩步骤,小头发样品的水冲洗毛皮被胰蛋白酶消化了两个小时。形成的裂解肽,源于各种结构蛋白的头发被MALDI-ToF质谱测量,根据他们的安排分子weight-to-charge比(m / z)。通过这种方式,mass-intensity光谱(m / zint)的特异性肽生成模式。数据关系正常化后,mass-relative强度谱(m / zint_rel,我)从这些原始数据和用于计算相关距离相似度比较,欧几里得距离的一种形式,作为衡量两个质谱光谱一致。光谱比较未知的样本参考物种对光谱数据进行存储在SIAM-data基地。他们的结果排名根据减少相似。从相关距离数据,经典多维标度的方法进行。显示了复杂的相似性关系投影到二维空间。

方法是基于假设个体从一个物种携带的角蛋白分子变异不同于个人与其他物种中找到。因此,光谱相似性的胰蛋白酶的角蛋白不同物种的模式或更高的分类类别(即属、部落、家庭)减少分类距离。为了达到正确识别至关重要咨询一个可靠的数据库,即保证:(a)参考样品是分类学的确认;(b)相同的实验过程是所有样品申请;(c)此外,大多数相关的物种有不同的质量谱模式。建立相应的引用库可能是一个复杂的过程,涉及不同组科学家和机构间的合作。

鉴定考古标本也支持相结合的肽质量指纹和collision-induced离解产品离子女士选择肽后胰蛋白酶的消化。女士光谱及其产生的MS / MS碎片光谱被提交给一个吉祥物MS / MS离子对公开NCBI冗余搜索蛋白质数据库(国家卫生研究院马里兰州贝塞斯达)来识别肽序列完全匹配的现存相关已知序列的生物。然而,必须注意分配质疑时序列相似性最高的物种,因为这种方法不提供任何信息,如果不存在未知的物种在数据库中作为参考。这可能是一个外来物种的问题,虽然很多头发角蛋白从家养的哺乳动物的特征。

图1所示。两个正常化mass-intensity光谱具有样品哈2/91和down-mirrored哈的6/91m / z1000年到3000年。指导质量给出了大胆和诊断山峰展露无遗。

图2。2-D-visualisation的两个主要因素导致经典多维标度的相关距离肽质谱在哺乳动物和四个考古具有样本标记为公顷2 - 5 - 6/91公顷43/130/91。高山环境的物种。彩色圆圈表示个人独特的动物测试订单:绿色偶蹄目,蓝色灵长类动物,红食肉类,黄色兔类,灰色Soricomorpha和浅棕色啮齿目。彩色数字方括号代表指导群众。领先的质量表示的范围相同颜色的圆线。

仪表

MALDI-ToF质谱

在4800 TOF / TOF分析仪分析质谱仪(应用生物系统公司,达姆施塔特,德国)积极反射模式。系统使用一个200赫兹脉冲固态Nd: Yag激光波长为355 nm。激光能量被设定为标准和3000辆2560辆真正的样本。源1电压设置为20 kV的栅极电压16千伏。反射器电压为2.19伏特。光谱标准肽用于广泛覆盖从0.8 kDa 4 kDa校准测量延迟时间600 ns。一个质谱是由20 sub-spectra /现场使用25接受激光枪。从六个标准肽只使用单一同位素的离子和计算的最小信噪比20,分辨率比10000。质量公差是设置为±0.2达最大的离群值5 ppm。接受校准设置是用来测量真实样品光谱范围内的1 - 3.5 kDa的最小信噪比范围10,分辨率比8000。

MALDI-ToF / ToF-tandem质谱分析

前体离子在MS / MS研究单一同位素的四位小数。质量公差是设置为±0.2 Da,栅极电压的电压源到8千伏7.361 kV和4500单位的激光功率。空气被选为碰撞气体。CID战斗识别镜头将4 kV和碰撞细胞7千伏。加速电压源之间的电位差和碰撞单元被设置为2千伏。MALDI-TOF TOF-MS /女士在反射光谱测量正离子模式。Glu¹血纤维蛋白肽B被校准的理论单一同位素的质荷比(m / z)1570.6758,50分光谱与100年拍摄每个积累了一个MS / MS谱。四5上市离解肽前体离子的离子被发现了校准与信噪比(S / N)比50。这些仪器参数也被用于前体离子的样品。

MS和MS和MS / MS搜索相结合进行木乃伊的样本使用自动程序从GPS-Explorer软件(应用生物系统公司,达姆施塔特,德国;3.6版本)和吉祥物搜索引擎(矩阵科技有限公司,波士顿,MA,美国)(www.matrixscience.com)。女士搜索没有蛋白质质量或起源物种限制集。肽质量公差50 ppm是错过了乳沟。Carboxymethylation半胱氨酸和蛋氨酸氧化被选为变量的修改。对MS / MS测量,前体离子宽容是设置为200 ppm和MS / MS碎片公差0.3哒。

MS和MS和MS / MS搜索相结合进行使用数据库国家生物技术信息中心(NCBI,马里兰州贝塞斯达美国;主页(www.ncbi.nlm.nih.gov)]。95%显著性水平(p< 0.05)选择基于Mowse分数计算。女士搜索Mowse得分已经超过67年和80年对MS和MS / MS搜索相结合,分别。

结果

与年龄相关的偏差在冰人的质谱

导致质谱测量的木乃伊样本显示适度减少数量的检测肽相比最近的样本。进展蛋白质腐烂在木乃伊的样本是因果峰数目减少。旁边哦^{- - - - - -。}其他激进分子reactiveo抗氧化年代pecies (ROS)已知攻击的骨干和侧链的蛋白质。在水的存在,O₂和O₂^{- - - - - -。}激进分子,蛋白骨干经过几个氨基酸残基。此外,胰蛋白酶乳沟网站精氨酸和赖氨酸的使用方法,可能被胰蛋白酶derivatised因此不再劈得开的。其他氨基酸侧链也可以接受derivatisation导致改变衍生品。山峰的总数在考古的光谱样本将扩大相关距离与参考物种相比。

诊断肽离子和指导群众

木乃伊的光谱显示一系列的胰蛋白酶的肽离子被识别作为特定对于大多数偶蹄动物物种,早些时候与基本特征诊断离子m / z1151年、1449年、1504年和2086年(图1)。此外,指导质量m / z1109年被发现的通用指标Bovidae-Cervidae集群。这些群众被发现在所有四个样品,没有其他订单被观察到的特征离子。此外,离子m / z3294年、2519年和2595年被发现,是牛羊的特征。m / z3266只发生结合m / z2519年和2595年的牛的说明。诊断为偶蹄类肽离子表(表1)是用来排除诊断肽组物种不同意。的存在m / z3294但失踪单m / z3266公顷43/91/130指着羊,公顷6/91和5/91公顷,而2/91公顷被确认为牛使用m / z结合2519年、2595年和3266年。

表1。诊断山峰从选定的物种偶蹄动物和同行考古样品。m / z值以粗体作为诊断的山峰偶蹄目。此外,m / z1109年(#)被用作指导的质量牛科- - - - - -鹿科集群。这个集群的成员标记为淡红色。诊断峰值大众强调作为前体离子物种鉴定。m / z2622标注(*)只是确认为诊断高峰使用MS / MS分析。

经典多维标度

2-D-visualisation的正常化具有样品的质谱显示最高相似绵羊、山羊和牛参考合并成一个独特的物种Bovidae-Cervidae集群和指导质量(图1)m / z1109年。来自不同家庭的其他物种集群和/或订单可以排除潜在的身份与样本具有很大距离Bovidae-Cervidae野猪集群或不同指导质量(m / z分别为2487)。

MS和MS / MS数据基本搜索相结合

寻找宿主蛋白胰蛋白酶的消化的木乃伊的样本导致四牛的角蛋白2/91公顷所有使用时非常重要的m / z2519年作为唯一的前体离子。然而,绵羊和山羊的角蛋白没有超过阈值的意义有一个例外的羊毛角蛋白羊躺在(表2)。其他三个样本显示显著的结果与绵羊和山羊的角蛋白在使用m / z1109年、1504年、2519年和2595年作为前体离子。绵羊和山羊的角蛋白仅略有不同很难区分他们甚至通过合并MS和MS / MS搜索。

表2。匹配的结果合并MS和MS / MS搜索使用光谱数据的四个木乃伊样品一起m / z2519年作为单一前体离子。NCBI数据库与吉祥物使用搜索引擎。选择Mowse得分显著性水平> 80p< 0.05。大胆的重要结果。最大数量的点击量设置为20。蛋白质内没有找到20最好设置为“和”。

结论

不同的测定步骤导致一致的结果,为识别的四个具有样本。从牛哈无疑是2/91,而其他三个样本来自羊。这些发现的驯化物种起源的所有四个样本表明访问原则的服装和营养来源。agro-pastoral社会可以作为社会文化基础具有社会更加进步比以前认为。暹罗进一步调查的其他部分服装已经启动,可能会提供一个更完整的概述为他配备可用频谱的物种起源。

引用

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