MarekŠebela

蛋白质生物化学和蛋白质组学、生物技术和农业研究中心地区的汉娜,理学院,深造大学,奥,捷克共和国。电子邮件:(电子邮件保护)

介绍

本文简要描述了使用matrix-assisted激光解吸电离(MALDI) /质谱(MS)分析核酸。虽然这个方法的应用受限于研究DNA或RNA分子的大小,它允许确定其分子质量精度高,还有几个MALDI-based方法阅读核苷酸序列。

MALDI-MS已成为广受欢迎的质量分析生物分子包括生物聚合物和合成化合物。谱过程始于嵌入分子co-crystals在合适的矩阵分析物的化合物,存在于一个高过剩和吸收光能量在给定的激光波长,以促进电离作用过程。不同的激光紫外(UV)和红外(IR)地区已经探索了这种技术,但目前氮激光器(λ_马克斯= 337海里)或一个Nd: YAG激光(λ_马克斯= 355海里)通常用于生物研究。¹常用方法成为引入以来实验室在1990年代,各种分子如蛋白质、多肽、寡糖、寡核苷酸或小分布(例如完整tRNA分子或从Sanger测序DNA片段)以及合成聚合物已被证明适合常规测量。适用的方法目前还完整的细胞和微生物孢子和薄组织样本(在这种情况下通过MALDI成像装置)用于诊断目的在科学、医学和技术。¹

核酸吸引了注意力的生物化学家,生物学家,药用研究人员、医师、法医科学家和bioinformaticists作为生命的关键分子。他们是生物聚合物组成的脱氧核苷酸(DNA)或核苷酸(RNA),每个包含一个糖、磷酸组和四氮基地之一。²DNA成分包括2′脱氧核糖、磷酸腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)。RNA含有核糖,磷酸盐和同一基地除了胸腺嘧啶,取而代之的是尿嘧啶(U)。作为结构单元,核苷是由连接形成的嘌呤碱基的N9原子和G或N1原子的嘧啶碱基C和T(或U在RNA)的C1′原子各自的糖。对核苷与另一个磷酸基连接到3′羟基群核苷和5′羟基组相邻核苷从而构成这样一个磷酸二酯键(见图1)。双螺旋DNA时形成两个杂交反平行的多核苷酸链线圈在一个共同的轴。链是由每一对互补的碱基之间的氢键:t或g c。还有一个堆垛相邻碱基对的互动参与一个稳定的角色。²

图1所示。一个计划的单链DNA和RNA的化学结构。R标志代表在RNA和DNA的H哦;B代表任何相关的杂环基(A、C、G和T DNA和A, C、G或U在RNA)。

MALDI-MS测量与寡核苷酸

寡核苷酸是寡聚物的核苷酸或脱氧核苷酸与广泛的应用于分子生物学和遗传学、医学和法医科学。³天然寡核苷酸表示,例如,通过小RNA分子与特定功能基因表达的规定(微RNA)或他们是来自核酸大分子的降解。合成寡核苷酸单链准备商业产品根据客户指定的序列的固相的反应从核苷phosphoramidites作为构建块。³3′,5′的链增长方向,向后相对于生物合成。整个过程都是自动的和最终产品的色谱分析,以确保高水平的纯度。通常情况下,合成寡核苷酸找到他们的应用程序在一个聚合酶链反应(PCR), DNA测序的分子生物学方法,人工合成基因和分子探针。利用他们的财产的大部分应用程序特定的绑定和寡核苷酸互补的核苷酸序列。互补的原则是根本不同的分析技术,如DNA / RNA印迹,DNA微阵列或荧光原位杂交(鱼)。

寡核苷酸的女士和DNA的进步尤为快速自引入电喷雾电离(ESI)和谱。伯纳德斯宾格勒和同事在1990年出版的分析短oligodeoxyribonucleotides(五个一四聚体)在正离子模式下由获得质谱谱仪器配备了Nd: YAG激光(λ_马克斯= 266 nm)和飞行时间(TOF)质量分析器使用烟酸作为一个矩阵。⁴钠和钾的寡核苷酸盐测量样品和他们同时解吸形成多个山峰质谱(反映各种数量的金属阳离子绑定到氧原子的磷酸二酯组)被证明是一个重要的原因大大降低质量分辨率和信号强度值相比,女士光谱相应多肽或蛋白质的分子质量。这样的一个障碍是可以克服的圆满通过交换碱金属离子和铵离子。这是实现通过添加铵盐(如柠檬酸氢二铵或diammonium-l-tartrate)在一个示例解决方案或使用NH过剩₄⁺)下载阳离子交换珠子。²铵离子可以传输一个质子在气相产生的游离酸磷酸二酯组和一个氨分子。因此,[M - H]^{- - - - - -}或[M + H)⁺离子形成取决于所使用的电离作用模式。之后引入3-hydroxypicolinic酸(3-HPA)作为一种有效的矩阵UV-MALDI寡核苷酸,⁵质谱可以使用这两种离子极性获得同等质量。已经表明,线性TOF质量分析器提供更强的信号强度和更好的分子质量分辨率值大于25-mers反射系统相比,这是由于在传输过程中损失的离子通过反射器和一个亚稳态的衰减。

UV-MALDI还有其他一些矩阵,已报告适用于实验与寡核苷酸(但他们是有用的,而分子小于25-mers):邻氨基苯甲酸与烟碱酸混合物;2′,4′,6′-trihydroxyacetophenone;6-aza-2-thiothymine;5-methoxysalicylic酸;4-diaminobenzophenone喹纳酸和3日。2,5-dihydroxybenzoic酸,这是通常用于多肽,是适用的和可用的二进制矩阵组成的,例如,3-HPA和硝基吡啶甲酸电影或3-HPA pyrazinecarboxylic酸。这些矩阵的使用被描述在以前的评论文章,例如参考2。的tetraamine精胺,亚甲蓝或βb-melanocyte-stimulating激素(肽)已被发现是有用的作为添加剂,稳定好小双螺旋DNA结构在MALDI-MS反对他们的分离。⁶合成寡核苷酸(即单链DNA)通常是测量100 -即,相当于大约35 kDa的分子质量。寡核苷酸的峰值的原因是质量分辨率下降(尽管样品净化和脱盐)增加大小。与DNA,更大的rna(如成绩单)等可以有效地分析在MALDI-TOF工具461 - mer因为他们更高的稳定性。²

DNA测序和MALDI-MS

DNA测序的实验方法是阅读的确切顺序的核苷酸(换句话说,秩序的四个腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶)的DNA分子。因此它可以用来确定感兴趣的基因的序列,基因簇,染色体或整个基因组。这种信息已经成为不可或缺的生命科学,特别是在分子生物学、基因组学和遗传学,和在应用领域如医学、法医学和生物技术。⁷

经典的DNA测序方法的发展,出现在1970年代,很大程度上刺激了DNA双螺旋结构的发现在英国1953年,沃森和克里克和遗传密码Nirenberg集团于1965年在美国。³因为他们的大小、序列测定DNA分子最初分析RNA等远远落后。1970年代初,吴射线和弗雷德里克·桑格独立与同事介绍实验室DNA聚合酶和引物延伸策略³²P-labelled核苷酸生产放射性DNA片段的长度(即定义的模板链区域)的副本服从一个序列阅读。桑格和库尔森设计的“+、-”方法允许读取DNA序列直接从电泳凝胶分离分析的放射能照像。⁷这个创新的概念居住在单独使用四双+和-反应混合物与每个反应受限于一个特定的deoxynucleoside三磷酸(核苷酸)。1977年,桑格的小组在剑桥(英国)引入链终止抑制剂(即2′,3′-dideoxynucleoside三磷酸腺苷;ddNTPs)和应用他们的DNA噬菌体fX174。⁸在这个协议中,复制链扩展直到ddNTP合并。这个过程很快就自动成为选择的方法从1980年代到2000年代中期克服当代化学法由艾伦之一和沃尔特·吉尔伯特利用base-specific化学裂解反应生成end-labelled DNA片段。在那段时期,有了重要的进展,如荧光标签和毛细管电泳。第一个完整基因组序列独立生存的生物决定的机会性致病细菌嗜血杆菌流感嗜血杆菌在1995年。然而,桑格法已经成为很大程度上促进了特别是因为人类基因组计划的实施。⁷

低成本和高通量测序的高需求驱动的各种“下一代”技术的发展,许多并行序列分析涉及,例如,大型DNA分子的分裂,适配器序列的绑定,固相的反应,小型化,luciferase-based检测或结扎的寡核苷酸探针。这个话题已经回顾了文献中,⁷因此只有焦磷酸测序可以明确提到作为一种突破。

MALDI-MS保持酶的合成DNA 3-HPA作为矩阵分析法已经被报道在早期的将该方法引入到实验室中常用的用法。²1993年,菲茨杰拉德et al。为例,探索四个模拟测序混合物包含17-41-mer寡核苷酸与一个终止,C、G和t的基础个体四个样品的质谱,所需的序列可以读取获得的阶梯。⁹从桑格的混合物dideoxynucleotide-terminated寡核苷酸测序反应成为可用的分析后MALDI-MS包括适当的净化去除缓冲盐和其他杂质。测序分析产品的方法是更有效当所有四个反应在一个瓶女士之前进行。¹⁰使用MALDI-MS DNA测序在1990年代是具有挑战性的,但研究人员然后很快意识到,这种方法仅限于比100个核苷酸短DNA序列。这个缺陷加剧了连续引入有利的“下一代”测序系统在过去的十年里。由于这些原因MS-based测序基因分型结果主要是有限的,检测的突变和单核苷酸多态性(snp)。单核苷酸多态性是biallelic多态性与DNA变异的个体。核苷酸的身份在这些位置通常局限于两种可能性之一。一个特定的SNP等位基因的存在可以被看作是一个诱发因素在人类遗传病和筛查的检测它的存在可能会使疾病的遗传倾向。¹¹有许多好处,使MALDI-MS一个优秀的平台,研究单核苷酸多态性:分析物的直接检测,精度高,优秀的决议,简单的试验设计和分析时间缩短。原则通常驻留在一个引物延伸反应引物退火的扩展网站立即毗邻研究SNP。的关键特性是使用双脱氧终止剂的混合物。这种安排收益率等扩展产品,不同长度(allele-specific地)导致大规模分离离子反映两个等位基因之间等于核苷酸(~ 300 Da)的质量,因此很容易解释。¹¹

反向Sanger测序雇佣α-thiophosphate-containing核苷酸(α-S-dNTPs)而不是ddNTPs。four-aliquot的完整的产品都受到严格的核酸外切酶测序反应为每个不同的基础治疗收益率序列梯子酶生成碎片与硫代磷酸盐链终止。这种方法已经结合MALDI-MS DNA的测序¹²DNA或RNA(通过转录模板在α-S-dNTPs)。¹³另一个协议与DNA转录涉及base-specific核糖核酸酶消化为MALDI-MS生成RNA片段¹⁴或嵌合RNA / DNA可以产生的DNA聚合酶在反应中加入核苷酸和脱氧核苷酸混合物。¹⁵产品受到一个碱性水解,而收益率分裂只在核苷酸网站。为研究RNA, C和U只有1之间的质量差异大。因此需要更高质量精度。

图2。期间形成的X -和Y-ions提示碎片MALDI-MS的寡核苷酸。这个计划被改编自参考16。dX和dY符号表示相应的片段链。

图3。MALDI-TOF质谱显示碎片合成寡核苷酸。光谱测量使用1:1 (v / v)邻氨基苯甲酸(50毫克mL的混合物¹在v / v乙腈50%)和3-HPA(50毫克毫升¹在50% v / v乙腈)含有柠檬酸氢二铵(1毫克毫升¹)作为一个矩阵在相对高的激光功率20%比通常使用的仪器完好的寡核苷酸分子质量决定的。谱探测器是由沉淀样本下降到矩阵晶体在目标和等待一个完整的干燥。序列的寡核苷酸5′-CGTGGATCCTTATAGCCAAGCTGGGTTGTGCAGA几乎完全可以读按照相反的顺序(以红色突出显示大写字母),从3′端,使用一系列Y-ions。

在MALDI-MS寡核苷酸的碎片离子

核酸的碎片离子MALDI-TOF女士被Nordhoff全面回顾了et al。²和完整的描述已经超出了本文的范围。它可以分为类别等提示,快速和亚稳态。高oligodeoxyribonucleotide碎片离子增加强烈倾向与分子质量增加。首选的分裂方案在MALDI-MS涉及nucleobase淘汰赛其次是糖磷酸骨干的分裂。寡核苷酸碎片减少订单的稳定oligothymidylic酸(oligouridylic酸)> RNA > DNA。RNA更稳定是由于电负性的影响2′羟基组的N糖苷键,从而防止消除女士的碱基和导致更高的灵敏度测量。提示oligodeoxyribonucleotides造成分裂的碎片离子糖磷酸骨架(参见图2)。¹⁶一个模态的主要离子系列IR-MALDI-MS计价与琥珀酸作为矩阵X, X * (= X + 80)和y在UV-MALDI-MS Y-ions观察2,5-dihydroxybenzoic酸或邻氨基苯甲酸与烟碱酸混合物而不是使用3-HPA。²

在典型UV-MALDI测量进行分析的分子质量oligodeoxyribonucleotide,激光功率通常举行一个阈值水平以达到可能的最高的分辨率,因此质量精度。当激光功率增加20%左右,分裂是观察(一种将衰变测量)。片段山峰形成一个梯子,序列信息。图3显示了实验使用3-HPA和邻氨基苯甲酸的混合物作为二进制矩阵。大量的碎片离子可以被识别的序列使用免费的web应用软件(计算器)OligoCalc等寡核苷酸(http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html)。

结论

DNA测序已成为常规手术。有现代和高效的工具用于这一目的的研究,诊断和技术实验室,或一个可以利用的商业服务。在这个领域发展的驱动力的方法是连续的,因为广泛的生物学家要求在短时间内产生大量的测序数据和最低的价格。MALDI-TOF质谱被认为是在1990年代的一大竞争对手传统分子生物的DNA测序方法。的主要原因居住在强调它的准确性和灵敏度。如今的角色MS-based核酸测序方法不属于主流。然而,有几个有趣的实际应用,包括,例如,寡核苷酸合成的验证标准或修改,描述天然改性核酸和多态性。

确认

这项工作是支持的批准号L01204从教育部、青年和体育,捷克共和国(国家项目的可持续性)。Štěpan Kouřil感谢他帮助分裂分析如图3所示。

引用

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