玛蒂娜Marchetti-Deschmann Gunter Allmaier
化学技术研究所和分析,维也纳技术大学Getreidemarkt 9/164-IAC, a - 1060奥地利的维也纳
介绍
天然乳胶被阿兹特克印第安人准备鞋子,瓶子,球在哥伦布发现美洲大陆前文明和其他产品。乳胶生产的乳管,专门细胞位于橡胶树树皮下的直接,和收获是乳胶牛奶的周期性切口树皮(攻丝)。乳胶牛奶是一种胶体分散系组成的30 - 38%的橡胶聚合物粒子,60 - 70%的水,1 - 2%的蛋白质,2%的树脂,1%的脂质,5 - 8%的低聚糖和0.5%的无机盐。防止凝固的新鲜了牛奶,0.7%(高含氨乳胶)或0.2%(低使氨化乳胶)添加氨,牛奶是离心机的橡胶含量> 60%。辅机抑制真菌或细菌侵扰混,和准备的牛奶是运往世界各地。
超过50%的世界生产乳胶牛奶用于浸渍制品。天然橡胶乳胶(海军)手套是由浸渍瓷形式变成一个专门准备的乳胶牛奶混合物,在其他事物之外橡胶的硫化加速器,抗老化添加剂和润滑剂。浸渍后,清洗(浸出)和干燥过程遵循直到脱下模具产品。根据最终产品,氯化和/或淀粉粉治疗预防依从性和改善随后穿着舒适。随着越来越多的注意力转向戴医用手套来降低感染的风险(例如HIV),过敏的发生与海军产品显著增加。1最常见的过敏类型IV型过敏,接触性皮炎发生6-48小时后联系,一般由添加剂不能完全清除。I型过敏,系统由循环IgE抗体蛋白质引起的过敏反应在海军,1927年首次报道。2第一个明确直接类型的过敏是在1979年报道的,3但水溶性蛋白质的第一个证据(MW > 30 kDa)海军作为一个潜在的发起者为I型过敏直到1986年才报道。4
自1990年代初以来密集在乳胶已经开展调查,采用一系列的分析方法,如高效液相色谱法(HPLC),凝胶电泳(GE),凝胶过滤或免疫印迹,透露信息乳胶过敏原(戊肝病毒b 1-13) 13日,所有注册的国际联盟免疫社会(iui)。5一般认为,残差在海军完成产品的数量决定产品的过敏效力。I型allergy-inducing化学物质通常是有效地移除在浸出过程和非常好的分析测试方法可以证明手套的总体符合规定。6然而,蛋白质含量的准确测量,以评估IV型过敏可能仍然是一个挑战既是调节方法,总蛋白质含量7和免疫学测试,8高度依赖一个全面的蛋白质提取过程。内在和外在的直接分析乳胶手套表面使用matrix-assisted激光解吸/电离离子流动四极飞行时间质谱(MALDI-IM-QToF-MS)检测过敏原目前预计将有助于克服,至少部分,问题的不完整的蛋白质提取/检测。女士结果标准分析方法相比,使用HPLC-UV检测和sds - page结合免疫印迹。
方法
不同类型的商用海军研究实验室手套被削减,碾碎成碎片不大于2×2毫米。0.4 g的粉提取1毫升样品为通用电气根据Lammli缓冲区9通过沸腾。对蛋白质浓缩/净化超滤应用。25µL浓缩提取分析了反相(C18)高效液相色谱应用三氟乙酸(组织)在水/乙腈梯度。每个高效液相色谱的氨基酸(AA)内容部分也被确定。10海军研究实验室手套总提取和高效液相色谱法分离单分数被通用电气快速和简单的蛋白质分离检测。完整的实验细节可以在10 - 12的引用。直接主管手套分析,分析规避关键蛋白质提取,MALDI-IM-QToF女士(水域,Synapt hdm),是应用。这个手套是用水冲洗删除任何多余的残留物(如淀粉)和切成小块(约2×2毫米)。这些作品被固定在一个谱的目标(请参见图4)后,使用双面胶带感兴趣的一面。固定手套表面蚀刻后0.5µL组织在室温下干燥。然后应用MALDI基质。,等待最好的结果一个特殊矩阵混合使用。11谱质谱(m / z范围:4000 - 16000)被收购,光栅的表面面积150µm×150µm积累1000没有质谱。
结果
如图1所示的很多信号HPLC-UV海军研究实验室的分析后可以发现手套提取证明完成的非常复杂的成分乳胶产品。样品缓冲成分很容易被分配(用黄色突出显示在图1 a)和剩余的大部分信号进一步分配给橡胶的硫化助剂,加速器或润滑剂。12海军研究实验室过敏原是研究的重点和蛋白质通常是很容易检测到通用电气分离和Coomassie染色后,总手套提取和高效液相色谱法分数,收集每一分钟(由相应的分数),分析了16% Tricine凝胶(图1 b)。在分数25之间的微弱的涂片3 kDa和14.2 kDa检测但海军过敏原的存在的证据,湛蓝的色彩区分的蛋白带,之前没有发现分数29-31(宽带kDa 5点)和34-36(两个截然不同的乐队在14 kDa)。定量AA分析(20常见AAs)排除了微弱的乐队在分数25是蛋白质,但证实蛋白质分数29-31和品种马非常(表1)。乐队也显示出积极的免疫反应的蛋白质(强大的温和的分数月29日到31日分数34-36)对多克隆b 1亨德拉病毒抗体。10t细胞增殖试验使用病人血清的海军的历史过敏证实过敏原的研究仍在敲定海军研究实验室手套产品。10先前确定的两种不同的乐队在分数34-36应用最先进的蛋白质组学工具,即数据库搜索后发现序列标签为胶液消化和女士实验。13
图1所示。(一)25µL总天然橡胶乳胶手套的提取(电泳缓冲)反相色谱分离。uv - 215 nm(蓝色),254 nm(绿色)和280海里(红色)。黄色box-buffer组件,红色rectangles-protein含有高效液相色谱分数,其他检测components-auxiliaries生产过程中添加。(B)总海军研究实验室手套的凝胶电泳分离提取(K)和高效液相色谱分数。
表1。量化了采用高效液相色谱法测定氨基酸含量。10
高效液相色谱法的一部分 |
氨基酸含量(µLµg / 100) |
8-16 |
1.77 |
17 - 18 |
1.16 |
21 - 22日 |
3.21 |
第23 - 25 |
3.40 |
29-31 |
54.28 |
32-33 |
7.70 |
品种马非常 |
15.58 |
39-40 |
3.01 |
41-43 |
1.96 |
44-46 |
0.51 |
47-48 |
0.06 |
49-50 |
0.19 |
上凝胶乐队在14.6 kDa代表戊肝病毒b 1,低蛋白质13.6 kDa是10氨基酸短形式的戊肝病毒b 1。分数29-31的蛋白质组学方法是不成功的,因此他们的某些利益。众所周知,戊肝病毒b 6,最好学习海军过敏原(kDa 20日),是加工成5 kDa n端结构域(戊肝病毒b 6.02,单一同位素的(m.i)分子质量4723.82 Da)和14 kDa C-domain 6.03 b (Hev)都表现出较高的临床反应,蛋白质决定分数29-31通用电气从这一点后怀疑是戊肝病毒b 6.02。检测的是,到目前为止,确定海军过敏原的检测除了5 kDa组件没有任何潜在的修改是感兴趣的。
所有分析方法在上述文献和报告有很高的潜在改变海军过敏原在手套,如通过水解(退化),氧化或侧链改性。然后不再清晰可辨,如果蛋白质改性生产过程或来自样品制备。因此检测蛋白质的解释乐队在13.6 kDa, 14.6 kDa通用电气可能是蛋白质样品制备的文物或截断确实发生在生产过程中。所以,直接确定准确的分子量(MW)的所有当前蛋白质在海军研究实验室手套没有敲定复杂样品制备是一个主要问题。此外,发展快速、简单的分析方法原位本地化的海军过敏原手套,如估计的潜在过敏性乳胶材料,是可取的。样品制备的协议是应用开发的一个二进制谱矩阵11TFA-etched乳胶手套表面允许直接测定不同蛋白质组件在海军研究实验室手套表面通过MALDI-IM-QToF质谱仪(图2)。著名的组件m / z4718.034 (m.i。;[M + H]+)与小陪同分析物的内表面上发现的乳胶手套,表面接触,例如,医疗工作者而不是病人。另外已经明确确定组件在13.6 kDa(截断戊肝病毒b 1)和14.6 kDa(戊肝病毒b 1)可被检测到。取得的高质量分辨率光谱仪m / z使m.i的检测范围。m / z值,导致许多戊肝病毒b的检测6某些AA伸长的变异和明确的作业。图2 b显示了一定的分配序列的变化m / z4718.034[丝氨酸(S)、甘氨酸(G)和谷氨酸(E)]只是部分前面描述的。11日14质量差异的两个主要的组件,m / z4718.034和m / z4699.997,可以确定为18.037 Da(图2)。对这种现象最可能的解释是pyroglutamic酸形成(E→Pyro-E,理论m.i.质量区别:-18.011 Da)。Pyro-E形成是一种常见的AA修改,自然或样品制备过程中引入的,那就是,在海军研究实验室手套表面的情况下,生产过程或MALDI样品制备本身。所有提到的顺序修改(+ S-G-E pyro-E)是在良好的协议序列如果发表的文献m / z4718.034接受是戊肝病毒b 6(图3)。第一个蛋白质序列的AA是E,因此pyro-E很可能形成。检测的信号暗示存在额外的原子吸收光谱法(S, G, E)指出,确定复合生物蛋白的加工形式,6.02 n端戊肝病毒b,但Hevein的降解产物,戊肝病毒b 6 (kDa 23日),出现在刚了海军牛奶。4717.034 MW的主要组件,确定哒,不是总共为戊肝病毒b 6.02协议发布的数据。可以计算-6.786 Da的质量差异。这一事实的序列变异不可能观察到生物处理戊肝病毒b 6.02检测,意味着在所有概率的主要组件来源于水解戊肝病毒b 6。这使得进一步的假设,现在不知道,修改很可能的序列。
图2。(一)正离子谱质谱记录在MALDI-IM-QToF-MS仪器直接从海军研究实验室手套的内表面。(B)的详细视图m / z范围相关分子的n端Hevein(主要乳胶过敏原)。能够清晰的分配序列伸长。(C)的高质量分辨率允许作业质量差异非常高的质量精度检测潜在pyro-glutamic酸形成18.011 Da)(理论单一同位素的质量差异。
图3。氨基酸序列的Hevein,戊肝病毒b 6及其子结构。红色rectangles-glutamic酸容易pyroglutamic酸形成和三个氨基酸被MALDI-IM-QToF-MS延伸成熟戊肝病毒b 6.02。
生产过程、浸渍的陶瓷形成海军牛奶,其次是干燥,广泛的浸出过程和脱模的模具,从而使产品内部,导致海军研究实验室的内部和外部表面手套不是相同的。海军研究实验室手套表面的直接分析是确凿的这一假设。女士的强度之间的信号m / z4718年和m / z4727 (m.i.分布的主要组件)内显著高于外表面(图4 b)。此外,执行所谓的MALDI成像实验检测的任务m / z价值观调查海军研究实验室手套表面上的特定位置,将此数据集转换成一个image-enables详细分析物的空间分布研究(图4 b)。
图4。谱图像女士:(A) 2×2毫米手套在MALDI样板。小块代表一个海军研究实验室手套的外表面,更大的内表面。(B)强度分布的情节最丰富的表面相关组件,戊肝病毒6 B的降解产物。
结论
谱高分辨率质谱直接证明戊肝病毒b 6和戊肝病毒b 1,截短形式,也存在医疗海军研究实验室手套的内表面。速度和高精度的应用方法和仪器使表面相关蛋白的检测可行之前没有任何蛋白质提取过程(原位本地化)。这是一个非常重要的事实作为人工蛋白质变更必须阻止。报告的例子演示了直接MALDI描述和MALDI成像质谱的工业处理后材料表面源自天然来源。
确认
我们感谢乔安娜·柯克帕特里克和马特·肯尼迪帮助Synapt高清质谱仪。
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