识别国内狗的毛皮,狸,兔子和家猫的头发使用MALDI-ToF质谱分析

Klaus Hollemeyer^一个沃尔夫冈Altmeyer^b和埃尔Heinzle^一个

^一个萨尔州大学生物化学工程学院Im圣johan Stadtwald, d - 66123 Saarbruecken,德国
^bGene-Facts GbR科技园1 Stuhlsatzenhausweg 67 d - 66123 Saarbruecken,德国

介绍

数年来,欧盟和美国的贸易市场存在激烈的讨论关于国内零售业在毛皮的狗,浣熊狗和猫。根据的观点,由于缺少用以调查,完全不同的数字是引用的这个不透明的贸易。动物保护组织认为数百万皮草的家犬,浣熊狗和猫正在进口,主要来自亚洲国家向美国和欧盟市场,他们在哪里卖的服装的文章。然而,另一方面,一些国家政府看不到任何需要采取行动,因为没有可靠的数据支持这样一种假设贸易。一些国家已经规定,包括美国、意大利、法国和比利时。这样的毛皮交易很难监控,因为缺乏可靠的方法明确识别驯养狗的毛皮,浣熊狗和猫,特别是化学脱脂、漂白或染色。到目前为止,尽管大多数专家不怀疑这种贸易的重要的存在,了解它的体积太少。也没有怀疑,至少国内猫狗皮毛贸易而言,消费者不愿意购买这样的衣服在任何情况下;此外,狸皮毛贸易越来越愤怒,越来越多的消费者。

非标签或误导性声明的产品部分或完全由国内的狗,浣熊猫狗皮毛帮助误导消费者,必须判断为作弊(见,例如,图1)。这种欺诈的新品种的贸易销售真皮草的人造皮毛,这主要是由浣熊犬。人造毛皮非常流行,看来买真正的皮毛是便宜比合成材料的零售市场。由于这个原因,美国国会也呼吁禁止在美国与狸毛皮贸易。在欧洲bdapp官方下载安卓版,欧盟委员会已经要求构建法律法规来克服地方法律要求与欧盟的公共精神,一定程度上阻碍自由交换的商品。假设规定也必须包含可靠方法为了有效监控任何计划的禁令。

图1所示。伪造的国内旅游狗皮毛从亚洲进口。毛皮是一个老虎的毛皮。很明显,典型的德国牧羊犬可以认可以及沿侧翼失踪的标记。

2003年秋季我们因此介绍了暹罗方法(年代pecies我牙发生的一个海洋动物米欧盟委员会ALDI-TOF质谱);这是一种分析方法适用于承认羽毛的起源、高信心通过质谱和头发。2006年11月,欧盟委员会提出了一个国内的猫狗皮毛交易的禁令,欧盟内部市场。¹替代微观和主成分回归(PCR)方法,暹罗方法开发与Gene-Facts公司合作,在我们的研究所被提到是非常可靠的。2这个提议,将2008年1月颁布,提供符合法规一起分析协议的客观监测任何国内的猫狗皮毛交易。

暹罗方法描述

暹罗方法经常用于禽类和哺乳动物物种的鉴定。该方法的可靠性,证实了使用未知的哺乳动物测试样本,LGC实验室³代表英国政府在2005年。PCR方法相比,暹罗方法也能够正确识别羽毛,哺乳动物的毛皮,即使化学处理如脱脂、漂白或染色。

方法,一小片1毫克的一个羽毛,或头发样本能充分进行分析,这是进行没有任何事前或事后分离或浓缩步骤。样品化学降低沸水浴中作为一个整体破坏,分子内二硫桥链和打破三维结构的蛋白质。冷却后,样本混合在一起并与胰蛋白酶孵化,endoproteolytic酶,裂解蛋白链到他们的赖氨酸和精氨酸残基。孵化发生在37°C两个小时。这个消化过程导致的裂解肽源于多种角蛋白和其他结构蛋白的头发或羽毛,分别。肽与CCA-matrix混合在一起,形成(αcyano-4-hydrox-ycinnamic酸在50%乙腈和稀释三氟乙酸),这个解决方案的和0.8μL下降到钢靶板和空气干燥。分析matrix-assisted激光解吸/ ionisation-time飞行(MALDI-ToF)质谱(MS)类型根据其分子裂解肽weight-to-charge比(m / z),形成肽模式特定的哺乳动物物种调查。肽的方法专门措施,但没有检测核苷酸或其他生物聚合物。比较未知的肽与已知物种的模式执行存储在数据图书馆参考条目。两个光谱之间的一致性越高,这意味着数学相关距离越小,越接近是动物这两个物种之间的关系。这导致可靠的未知样本的识别。额外的使用特有的山峰只发生在单一物种和用作诊断峰值提高研究结果的确认。

仪表

暹罗分析进行4800 ToF / ToF分析器质谱仪(应用生物系统公司,达姆施塔特,德国)正反射模式。系统使用200赫兹脉冲固体激光的波长355 nm。源1电压设置为20 kV的栅极电压16千伏。2.19 V是应用于reflectron探测器。混合的肽质量标准肽被用于大范围从0.8 kDa校准到4 kDa 600纳秒的延迟时间。(标准:des-arg1-bradykinin,血管紧张素I, glu1-fibrinopeptide, ACTH - 17, ACTH 18-39剪辑和ACTH 7-38剪辑)。一个标准肽质谱成立20 sub-spectra /现货;每25激光镜头保持探测器的饱和阈值以下。只单一同位素的山峰被考虑,计算从六个标准肽的最小信噪比20岁,分辨率比10000更好。质量公差是设置为±0.3达最大的离群值5 ppm。 Accepted internal calibration settings were used as default parameters to measure real-sample spectra in the range of 1–3 kDa with a minimum signal-to-noise range of 10, and a resolution better than 6000.

MALDI-ToF质量光谱测量安排裂解肽根据它们的分子质量m / z)形成一个质谱肽模式与他们特定的强度。几个单一质谱从一个样本,每个从不同的现货组合成一个重新计算平均频谱,从而消除胰蛋白酶autoproteolytic肽以及轻微的强度变化之间的单一的测量。纠正哺乳动物的平均光谱总是包含持续的肽质量发生在几乎所有哺乳动物调查订单。除了这些还有其他肽质量,有选择地代表动物家庭和/或属哺乳动物。种特异的肽,然而,发生只在单一物种,可以作为诊断质量。

平均光谱来自已知物种作为参考条目数据存储库。从未知物种的平均光谱识别的二进制数学比较与存储数据使用“相关距离”(d_{(r, s)}):

(EQN)

在[EQN]

和[EQN]

对对象之间的欧氏距离计算的关系n×p数据矩阵X。行X对应于观测;列对应的变量。d_{(r, s)}是一个行向量的长度(n- 1)×n/ 2,对应于(n- 1)×n/ 2双的观察X。的距离排列的顺序(1、2),(1、3)…(1)n),(2、3),…,(2,n),…,…,(n- 1,n)。d_{(r, s)}通常被用作不同矩阵在集群或多维标度。各种向量之间的距离x_r和x_年代被定义为相关距离。

向量d_{(r, s)}转换成一个方阵,元素我,我在矩阵对应于对象之间的距离我和j在原始数据。

这是一种特殊形式的欧几里得匹配系数的计算⁴从0到1.0。结果提出了一个距离值列表,即最小的距离值表示两个光谱之间的相似性最高,给最合适的方法。总结,可以说,在一个动物属或家庭的平均光谱相似性的最高水平,成为越来越小动物之间的距离变得越大两种哺乳动物。此外,这种行为反映了一种过去的记忆的头发藏在它的蛋白质。图2显示了集群树远亲个体,每个属于一个不同的动物。在任何情况下是一个相关的距离小于d_{(r, s)}= 0.6。相比之下,图3所示d_{(r, s)}分离为狸小至约0.2相比,国内的狗,两个密切相关的物种来自同一个家庭但不同属。集群的食肉动物显然是歧视的食草动物。

图2。系统树图的成员不同的动物的关系显示订单的肽模式头发消化。图中反映了系统聚类树。相关距离大于0.6表明遥远的关系。

图3。相关距离的哺乳动物物种从胰蛋白酶的头发质量光谱数据计算分析。

在过去的记忆的头发是非常实用的原因影响,未知物种可以分配至少一个动物属或家庭,即使没有一个相同的参考条目在图书馆。这可以特别有效,如果数据库中识别的水平设置为动物家庭或亚科。在未来,皮毛贸易将禁止交易的所有成员Pantherinae亚科,以及几乎所有的成员Felinae亚科在美国和欧盟。例如未知样品可以确认为Pantherinae没有精确匹配的物种的成员参考条目和被视为一个受保护的物种。

狸毛皮分化,国内的狗,兔子和家猫

从狸毛皮(Nyctereutes procyonoides)犬科家族和兔(Oryctolagus cuniculus兔科家族的)经常被误认为是国内狗(犬属后裔)和家猫(家猫),分别。此外,在许多情况下,特别是在美国,人造皮草时尚,真正狸皮出售,要么是没有标签或标签有误。不同的皮毛类型很难区分视觉,特别是漂白或染色。许多要求分析关注识别此类案件的嫌疑人毛皮样品。歧视的人造毛皮的毛皮很容易实现,因为合成聚合物不能被胰蛋白酶裂解,因此他们只能从胰蛋白酶产生一些auto-proteolytic肽本身。不幸的是大多数不能轻易承认造假。在这些情况下,暹罗方法是一种非常有用的工具。图4和图5显示的相似之处和不同的质谱的平均光谱胰蛋白酶的消化从狸反对国内针对家猫狗和兔子,分别。绿线表示常见的质量在两个光谱也显示类似的相对强度,和对比显示了两个物种之间的密切关系。如果黑色线条是显性的光谱比较,这两个物种是远亲。 Within the same family (domestic dog and raccoon dog) the distance is small withd_{(r, s)}= 0.1991,在食肉动物(貂,狗,猫,狸)的距离小于其他订单相比,像偶蹄目(羊)和兔类(兔子)(表1)。

图4。两个平均谱质谱从狸(向上)和国内的狗(向下)kDa的范围从1到3 kDa的相对强度。绿线代表相同的质量,黑色线条代表不同的群众和红线是诊断用于额外的区分峰值狸和国内的狗。

图5。两个平均谱质谱从兔(向上)和家猫(向下)kDa的范围从1到3 kDa的相对强度。绿线代表相同的质量,黑色线条代表不同的群众和红线是诊断峰用于额外的区分兔子和家猫。

表1。质谱数据的相关距离头发胰蛋白酶的消化与家猫狸对一些选定的物种。相关距离越大越小的光谱相似之处。

距离计算给浣熊和国内狗最好的比赛,但这价值在于之间的分布范围也对其他犬种(d_{(r, s)}= 0 - 0.5)。因此其他排除参数必须被考虑。表2显示了一些常用和诊断山峰女士在这个调查。而m / z1066是完全不具体的,m / z1109是偶蹄目秩序和独特的具体m / z1952兔科的家庭。进一步的山峰是特定物种,属和/或家庭。狸菌种的质量m / z1552年诊断峰值适合区别于国内狗样,狐狸,狼和郊狼。

表2。一些常见和诊断MALDI-ToF女士峰值发生在不同哺乳动物的家庭。

传说:“+”表示,“O”表示缺席

大大小小的兔子和猫之间的相似之处来自不同家庭的低相关性的距离d_{(r, s)}= 0.7742,如图6所示。歧视是确认的准确性对一些家庭使用不同的诊断质量具体的食肉动物的物种调查兔科的家庭。这些都是作为额外的排除标准。虽然一些食肉动物的家庭以及家庭的人科m / z1538质量峰,这质量是失踪在兔子和野兔(天兔座europaeus)光谱,这两个来自兔科家族。相比之下,两个兔科物种的m / z1992年质量不发生在任何食肉动物样品检查。

图6。相关距离大大小小的猫彼此间的分布。超过500人在猫科动物中进行比较。Inter-feline距离总是小于0.5。箭头显示了兔毛的光谱数据的距离比猫数据。

结论

暹罗的方法是快速和可靠的哺乳动物物种的识别工具。已经证明,兔毛的分化家猫的皮毛是明确的,没有歧义。关联两个物种之间的距离远远大于分布范围内大大小小的猫。每个猫光谱光谱可以清楚的区分出一只兔子。歧视的皮草狸从国内狗皮毛额外步骤是必要的。在第一步中所有其他家庭必须歧视从狗的距离计算。第二步使用菌种质量鉴定。在犬的家庭其他成员必须显示特定的诊断质量。

暹罗分析可以在几小时内进行。尽管我们使用的是高端reflectron设备MS-MS选项,一个线性MALDI-ToF质谱仪减少质量精度也可以被使用,因为我们只使用整数计算的质量。目前我们在谈判的主要制造商编译一个有吸引力的选择一个线性MALDI-ToF设备配备合适的分析软件和暹罗数据库,以满足快速增长的兴趣的方法。

引用

1. 猫狗皮毛:欧盟委员会提出了总禁令,从20/11/2006参考IP / 06/1586(http://europa.eu/rapid/pressReleaseAction.do)。
2. k Hollemeyer w . Altmeyer和e . Heinzle”识别和量化的羽毛,和头发的禽类和哺乳动物起源使用MALDI-TOF-mass光谱法”,肛交。化学。74年,5960 - 5968 (2002)。doi:https://doi.org/10.1021/ac020347f
3. LGC有限。注册在英国没有增值税。2991879 674 0567 21注册办公室:皇后路特丁顿,英国米德尔塞克斯,TW11 0 ly,。
4. MatLab R2006a软件MathWorks公司3苹果山纳蒂克,马01760 - 2098,美国。