量子级联激光中红外光谱化学成像的组织和biofluids

格雷姆·克莱门斯,^一个*本杰明鸟,^{b *}英里伟达,^b杰里米Rowlette^b和马修·j·贝克^{a、c *}

^一个化学材料科学中心部门,中央兰开夏大学普雷斯顿,英国PR1 2他。电子邮件:(电子邮件保护),(电子邮件保护)
^b科学日光Solutions Inc ., 15378大道,圣地亚哥,CA 92128,美国。电子邮件:(电子邮件保护)
^cWestCHEM,纯粹与应用化学,斯特拉思克莱德大学,格拉斯哥,教堂街295号
G1 1 xl,英国。电子邮件:(电子邮件保护)

介绍

中红外光谱成像是一个快速的新兴技术在生物医学研究和临床诊断,利用独特的分子指纹的细胞、组织和biofluids提供丰富的生化图像不需要染色。光谱分析允许的客观分类生物材料在分子水平上。¹这种“无标签”分子成像技术已经应用于组织学、细胞学、外科病理学、微生物学和干细胞研究,并且可以用来检测细微变化的基因组,蛋白质组,代谢组。^{2 - 4}生化信息的新财富提供这种技术有明显的潜在改善癌症病人的结果通过识别疾病的早期阶段,耐药性,新的疾病和高危人群。⁴然而,尽管这个科学的成熟度,仪表提供样品处理量增加,改善图像质量,占用空间小、低维护和需要最小光谱临床翻译专业知识是必不可少的。

最新一代的傅里叶变换红外(ir)光谱分析仪,结合大型液态氮冷却焦平面阵列(FPA)探测器在红外显微镜系统,毫无疑问加速发展的领域。平安险探测器是一个2 d装置,电磁波谱的红外敏感地区,由数组photon-sensitive透镜的焦平面像素。⁵显著改进数据采集、处理和分类,部分原因在于增加视野(FOV)这些FPA的基础设备,使光谱调查,现在包括临床相关的患者群体。⁶然而,尽管有这些明显改善相比,线性检测器阵列(LDA)或基于探测器的系统,数据收集时间从组织微阵列(TMA)核心部分或整个组织仍在几小时或几天内的秩序。⁷问题可以部分特征之间必须权衡空间和光谱分辨率和信噪比要求提供健壮的光谱分类。利用低放大目标增加了视场和记录数据的信噪比,从而允许更大区域的样本成像更迅速。然而,小空间特征在样本无法解决,因此需要高清晰度,衍射极限,空间分辨率的早期阶段疾病的识别和分类。然而,没有光子吞吐量可以从一个同步源,和高放大倍数的要求反射光学提供了减少FOV,收购时间可以显著增加获得足够的大小和信噪比的图像。此外,多元优势利用传统的基于傅里叶变换的系统可以计算的,需要大量的读出数据处理在随后的减少只有少数关键波长或光谱生物标志物用于分类。这导致一场辩论在光谱社区所有光谱频率是否需要收集一组特定的光谱生物标志物已确定,因此而探索更高效的non-interferometric数据收集的方法。

基于量子级联激光器中红外成像

最近,广泛可调中红外量子级联激光器(预审)已经成功地集成在显微镜在光谱化学成像的分子指纹区。⁸这种类型的显微镜的主要组件包括多个QCL模块,光学多路复用器,冷凝器,可切换的目标,一个自动化的阶段,一个FPA探测器系统。不再需要一个干涉仪,可以实现简单的仪器结构允许减少足迹;大约三分之一的高端商业红外板凳和显微镜系统。⁸这些广泛的高亮度可调QCL来源也使得使用大画幅(480×480像素)非冷却microbolometer探测器系统,消除需要低温冷却碲化镉汞(MCT)探测器系统。特别注意的发展目的设计高数值孔径(NA),消色差、广角和refractive-based红外目标。广泛的独特组合可调谐激光源,refractive-based目标优化相干光和一个大型格式探测器系统使得高清分辨率衍射极限,没有权衡在信噪比和视野,与傅立叶变换红外显微镜对其延长碳硅棒热光源。利用可调谐激光器作为源还提供了以前无法收集数据的新方法。实时离散频率光谱化学成像以每秒30帧是一种形态,可以提供一些独特的应用程序,允许用户快速屏幕大样本,少数重要的频率之间来回移动,提高样品的化学对比,帮助部分地区的疾病。这种类型的形态适合术中肿瘤筛查的冷冻活检组织或细胞的多路复用chemotyping biofluids。另一个独特的形态是执行一个稀疏的频率数据收集的能力,即一组目标的离散频率可以收集。在学习阶段的光谱诊断,这显然是明智的收购数据完整的光谱范围为我谱模式之间的类类型。然而,一旦学习阶段完成,最诊断光谱特性已确定,只有少数关键波长的目标列表需要收集的工具,从而大大提高采集时间和样品处理量。

高分辨率的中红外光谱化学成像的组织

当前的组织病理学诊断癌症的方法。这个方法需要一个训练有素的病理学家,通常专家(如神经病理学家),解释的形态学变化,细胞和组织架构作出诊断。这项技术还有很长的诊断窗口,可以非常主观。⁹限制这种诊断方式导致了感兴趣的光谱分析技术的发展为癌症的诊断。¹⁰

所有基于中红外显微镜系统都不可避免地受限于空间分辨率之间的权衡,信号噪声比,视野和采集时间。传统上与传统的桌上型FT-IR-based系统,实现真正的衍射极限分辨率,高放大目标最大可能NA的要求提供一个大幅减少的视野和扩展示例停顿时间达到一个可接受的信噪比组织分类的目的。¹¹之前严格的分析表明,它也必须提供一个有效像素间距~ l / 4假设的最佳商用NA ~ 0.65。然而,这些计算是基于一个圆形目标的模型,而古典卡塞格林目标是日环食。然而,当结合高放大目标的36×及以上,128×128像素FPA探测器系统,最好的视场目标实现的150µm×150µmµm 1.1像素的分辨率。考虑到这些局限性的应用高分辨率成像光谱组织分类是有限的,与偏好进行低分辨率成像大视场目标为了增加样本的吞吐量。最近,然而,高分辨率成像的应用对于临床诊断显示明显的优势的小组织结构的识别检测早期形式的疾病至关重要。¹²传统组织化学和免疫组织化学染色,尽管他们的缺点inter-observer变化形态的解释,仍然非常可靠的肿瘤识别和子类型化生产总值(gdp),提供一个困难的技术与红外光谱诊断破坏。然而,中红外光谱成像更有可能使一个真正的和有益的早些时候在病理学通过识别影响形式的疾病,不能被这些方法,和的特点是非常小的腺体的生化成分的改变,内皮和myoepithlial细胞或intra-lobular基质。因此,这一技术可以提供高保真光谱数据在这个规模可能临床翻译的必要条件。

的最近发展Spero™显微镜(日光Solutions Inc .,圣地亚哥、钙、美国),一个基于激光的中红外显微镜,提供的功能来执行衍射极限成像的分子指纹地区(900 - 1800厘米¹)尽管增强的视场。利用这个乐器的高放大refractive-based客观,有NA的0.7和12.5倍的放大,650µm的视场×650可以实现µm, sample-referred 1.36µm的像素大小。这相当于一个~ 20×增强的视场,使高分辨率成像的样品更可行的选择,并已通过美国空军测量(美国空军)军事目标和衍射极限分辨率可以达到5所示µm 1650厘米¹的峰值,对应一个典型的酰胺我乐队。软件通信升级将很快被释放,这将进一步减少数据采集时间大约5分钟每瓦900厘米的数据收集¹到1800厘米¹在4厘米¹决议。

图1显示了光谱图像的1650厘米¹带强度记录在medullablastoma和胶质母细胞瘤(类型的脑癌)组织核心片(直径约1.5毫米,5µm厚度,放在CaF₂衬底)使用QCL显微镜成像系统(A, C和E)和基于红外显微镜128×128像素FPA探测器系统(B, D和F)。图1 e和F显示放大的图像区域所反映出的白盒子在图1 c和D,分别。图像是通过执行一个3×3相机瓷砖马赛克的组织核心。QCL显微镜系统利用一个12.5×放大目标NA 0.7提供650年的视场×650µm和每瓦1.36µm的像素大小。数据从900厘米了¹到1800厘米¹4厘米的光谱分辨率¹2.1 h。拿了傅立叶变换红外显微镜利用15×放大目标的NA ~ 0.65提供一个700年的视场×700µm和每瓦5.5µm的像素大小。数据从950厘米了¹到3800厘米¹4厘米的光谱分辨率¹,1×零填充系数,Blackman哈里斯apodisation 2.25 h。所有的光谱数据在传输几何。

图1所示。1650 cm - 1带的光谱图像强度在medullablastoma (A和B)和胶质母细胞瘤(C, D, E和F)组织核心(大约1.5毫米直径和5µm厚度)成像使用Spero QCL显微镜(A, C和E)和一个128×128 FPA显微镜系统(B, D和F)。1 E和F的放大图像区域所反映出的白色盒子1 C和D的胶质母细胞瘤组织核心。光谱,从以黄色突出显示C和D所示的QCL显微镜(G)和傅立叶变换红外光谱microscope128×128系统(H

高分辨率数据获得使用QCL显微镜系统显然为图像提供卓越的清晰度和允许精细组织特性形象化。通过启用小而重要的组织特性来解决,光谱化学信息可以解锁不仅识别早期和罕见形式的疾病,而且孤立的小学和转移性肿瘤细胞,提供潜在的临床领域的发现以前没有信息。此外,一旦确定了诊断的一个子集歧视性的频率(见下面biofluid部分),可以显著降低收购次QCL-based系统以来,正如上面提到的,只能获取数据调到感兴趣的频率,因此允许更多的临床相关的时间表。这种技术具有巨大的潜力来帮助使光谱化学组织病理学和推进技术被应用在外科病理学为术中起着非常重要的决定。

广角biofluids的中红外光谱化学成像

Biofluids(如尿液和血清)提供一个便利,相对非侵入性的样本进行分析,收集可以执行全球和在该领域。¹³中红外光谱特征和分类的应用人类biofluids迅速新兴领域与众半岛综合体育官方APP下载德甲多的研究人员提供强有力的证据表明,原发性和转移性癌症和其他自身免疫性疾病可以识别和分类。¹⁴的成功部分是由于应用整体的方法,即整个生化组成biofluids审查,而不是一个小的子集生物标记,它通常可以误导的解释。¹³研究到目前为止已经完成使用各种不同的技术,即衰减全反射(ATR)和常规成像干biofluids斑点。^{15 - 17日}然而,一个可行的光谱方法对高吞吐量大的患者群体的多路复用筛选仍然缺乏。向此目的的一种方法可以快速红外成像biofluid点已准备在病人面向网格地图。例如,x尺寸的网格可以描述病人的biofluid剖面不同器官或生化提取组件,和y尺寸不同的病人。电影利用液滴技术时,圆形的直径1 - 2毫米的形成当使用0.5µL液体;最小的可靠测量使用手持吸量管。干点可以描述变量拓扑,但提供更重要的是通常被称为咖啡污渍效果,即形成厚环周围的边缘的位置。在这个环的数据记录通常是妥协的,因为吸光强度测量蛋白质乐队通常可以超出探测器响应的线性范围和显示饱和。然而,在中间的地方,一个大区域可以积极提取光谱分析。biofluids干有什么本质上的不同,比较优势在组织或细胞分析,是反过来的相对同质样本形态提供了相对自由的逆散射光谱数据。光谱资料显示,如果有的话,宽基线振荡允许构建健壮的分类算法没有严格的散射校正。

利用低放大率refractive-based QCL显微镜系统的目标,NA 0.15和4的放大×视场的2×2毫米。这个目标可以检查整个biofluid干点在单个相机拍摄,sample-referred像素大小为4.25µm和空间分辨率的25µm 1650厘米¹。给定样本的同质自然沉积,空间分辨率不是绝对必要的对于这种类型的分析,和广角成像功能允许更快速评估整个干点。因为这些类型的样品不提供不良散射配置文件也适合一个稀疏的频率数据收集协议,即减少了离散波长的数量是目标而不是收集更多的时间禁止全谱。

图2显示光谱成像分析,发现人类血清样本准备到CaF₂衬底。每个血清现货沉积手动使用micro-pipette和0.5µL每个病人样本,形成一个网格的2×5点。网格的列描述病人诊断为正常,大脑、肺、乳腺、皮肤癌症诊断,分别。每个沉积血清现货ca直径2毫米。整个电网的血清斑点随后分析使用广角4×客观的QCL显微镜系统使用一个离散频率集合协议。强度值在14离散波数(1000,1030,1080,1482,1520,1546,1570,1600,1630,1654,1686,1726,1734,1770厘米¹),与峰值最大值和肩膀的吸收光谱与脂质,蛋白质,核酸大分子碳水化合物,从共有24帧记录总时间50分钟(ca每瓦2分钟);这些吸收带曾被证明是显著不同的乐队当比较ATR /红外光谱记录从肿瘤和非肿瘤血清斑点。^16、17图2中的图像是由策划记录强度值为1654厘米¹并允许血清形态很容易想起,常常强调的咖啡环形状血清存款的外边缘;空间区域的图像镶嵌在红色突出显示对应于高吸收1654厘米¹和空间区域的图像镶嵌在蓝色突出显示对应于没有吸收或吸收很少的1654厘米¹。利用探针样品吸光度的质量检验,一个阈值准则是利用提取像素包含在血清的中心部分景点,没有描述饱和的酰胺和二酰胺蛋白质特定的乐队。剩下的多元数据(最优化)11日分析离散频率(1482,1520,1546,1570,1600,1630,1654,1686,1726,1734,1770厘米¹),主要描述蛋白质和脂质,为了评估他们段病变患者健康的能力。图2 b显示所有提取光谱基线校正后,向量正常化。图2 c相反显示的平均光谱计算两个正常(黑)和两个脑癌(蓝色)血清斑点。即使在这个非常基本的平均谱面,这些团体之间的光谱差异可以形象化。更全面的使用所有的最优化分析光谱从正常和脑癌中提取血清斑点进行同时使用主成分分析(PCA),如图2所示,和峰值质心分析,如图2所示。PCA分析使用的所有11个离散频率数据,而使用九峰质心分析频率与酰胺我和二酰胺乐队。图中的每个点代表一个像素光谱,即黑的颜色代表一个正常诊断(3242光谱),脑癌和蓝色(1899光谱)。

图2。(一)马赛克图像血清获得利用常見的14个离散频率,脑癌、肺癌、乳腺癌和皮肤癌症患者;(B) baseline-corrected和向量正常血清光谱提取非癌症血清和脑癌的中心位置;(C)意味着从每个非癌症(黑)光谱和脑癌(蓝色)血清现货;(D) PCA几十块脑癌血清光谱(蓝色)和非癌血清光谱(黑色)和(E)质心分布峰值酰胺的情节我为脑癌和二酰胺乐队(蓝色)和非癌(黑)血清光谱。

这些初步结果(如图2所示)清楚地表明,通过记录数据数量减少的波长的结构形状的酰胺I和II吸收乐队仍然可以保持。因此,乐队的变化频率和频带结构形状的变化由于疾病状态记录数据仍然可以被捕获。因此,结果突出的优势,可以采用稀疏时频率集合范式对于诊断应用程序,没有造成损失的数据分类的准确性。特征常見的分化和脑癌血清点可以很容易地与PCA提取,然后一个稀疏的目标频率数据收集,实现健壮的分类使用峰值重心的转变的酰胺和二酰胺乐队。先前的调查在这项研究中,使用的血清样本,基于光谱数据收集使用传统的傅立叶变换红外光谱系统不仅从整个中窗口(4000 - 400厘米¹),发现同样的山峰和特性是涉及疾病的歧视。^16、17然而,这样的数据集由来自900多个波长的强度值维度,其中绝大多数是不重要的分类的目的,并且可以使计算昂贵的傅里叶变换,提取相关的波长。使用可调谐激光显微镜系统反过来允许集中收购所需的14个相关的中红外光谱特征分类,代表一个阶跃变化在光谱图像采集速度,在临床相关的时间尺度。进一步的研究正在进行,包括核酸的利用率和糖化相关的离散频率细分多个主要和转移性癌症,也利用先进的压电喷射沉积设备样本。

结论

QCL技术的出现和应用的中红外光谱微观评价生物医学样品可能会迅速扩大在未来几年。成功基于可调谐激光源与折射光学耦合和大房间温度FPA相机为实际光谱病理学打开了一扇新的大门。正如在这个贡献,光谱图像保真度和定义相关临床需要现在是可行的,和多路复用成像分析可以使用离散频率锁定协议执行。

确认

MJB和GC感激地承认EPSRC-funded临床红外和拉曼光谱的支持网络,CLIRSPEC (半岛综合体育官方APP下载德甲www.clirspec.org),(EP / L012952/1)资金来进行这些实验

引用

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