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与tr-FT-IR蛋白质反应:解决

2007年6月1日|文章
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2007年
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与tr-FT-IR蛋白质反应:解决

卡斯滕•科特和克劳斯Gerwert

Lehrstuhl皮毛Biophysik, Ruhr-Universitat波鸿,44780波鸿,德国。电子邮件:(电子邮件保护),(电子邮件保护)

后基因组时代,生命科学的重点转向蛋白质。基于蛋白质的各种状态之间的区别,时间分辨傅里叶变换(tr-FT-IR)光谱学可以选择性地检测,与纳秒分辨率,氨基酸的反应,配体和蛋白质的特定水分子活性中心,从而提供一个详细的反应机理的理解。半岛综合体育官方APP下载德甲故障的蛋白质是许多疾病的原因。因此,了解结构、功能和相互作用的蛋白质在分子水平上的发展是至关重要的理性分子药物治疗。

蛋白质的三维结构可以由核磁共振光谱学或x射线晶体学。半岛综合体育官方APP下载德甲结构的测定一直是道路上的一个里程碑,了解蛋白质的功能。然而,通常只有基态的结构。这些方法Tr-FT半岛综合体育官方APP下载德甲-IR光谱是一个很好的补充;电荷分布信息,氢键和质子化作用状态。1 - 5这给直接洞察反应机理在原子水平。

吸收光谱的一种蛋白质

在图1中一个典型的吸收谱的蛋白质溶解在水中。由于大量的吸收,是不可能确定吸收个人组。主要吸收的是那些amide-I乐队(的总和所有C = O骨干伸展振动),amide-II乐队(的总和所有NH弯曲和骨干的CN伸展振动)和水的OH-bending振动。

图1所示。典型的蛋白质溶液的吸收光谱(这里是10毫米Ras)。主要的组件表示的颜色红色(C = O伸缩振动,酰胺I),蓝色(弯曲振动、水)和绿色(NH弯曲和CN伸缩振动,酰胺II)。插图中,两个蛋白质的吸收光谱,这只偏离在羧基的质子化作用,示意图所示。在下方,显示了这两个状态差光谱示意图。不变的背景吸收的蛋白质被取消的一部分;吸收反应小组正在解决。

不同光谱半岛综合体育官方APP下载德甲

获取信息对个人团体,我们必须检查不同光谱。在简单的情况下的反应→B,计算一个差分吸收光谱的两个州(B - a)的背景吸收蛋白质是大约103倍的吸收反应组。因此它是非常重要的保持测量条件完全相同。这包括使用一个空调房和一个孤立之表,和样品保持在分光计。因此,要启动的反应谱仪(触发)。光生物学的活性蛋白质激光闪光可以做到这一点。在其他情况下对光不稳的caged-compounds,辐照后释放生物活性物质,可以使用。此外,micro-mixing细胞允许混合两种反应物在毫秒级的时间内政权。ATR(衰减全反射)技术可以固定蛋白质与配体或其他表面,研究反应的蛋白质。6

图2。傅立叶变换红外光谱的基本原理。

tr-FT-IR的基本原理

傅立叶变换红外光谱仪的核心要素是迈克尔逊干涉仪。同时测量波长的红外源。在图2中使用单色源原则是例证。分光板后,梁是反映在一个固定镜子,另一束在一个移动的镜子。不同的腔长给wavelength-dependent干扰。对于镜像位置X1,不同的路径长Δxλ/ 2的结果后重组,因此两波干涉相消(红色)。同样的波长,但镜子位置X2,一个路径的差异nλ(这里n= 0)的结果,从而导致相长干涉。测量的结果是一个干涉图,强度是策划对镜子的位置。傅里叶变换后根据

\[{\科幻我\离开({\波浪字符\ν}\右)= \ int \ limits_ {- \ infty} ^ \ infty{我\离开({\δx} \右)}\因为\离开({2π\ \波浪字符\ν\δx} \右)dx} \]

单通道谱我(\{\科幻{\波浪字符\ν}}\))。在这里,\({\科幻{\波浪字符\ν}}\)是逆波长1 /λ。为我们的单色δ函数实现的例子。不同光谱如图3和图4是由两个单通道谱计算根据日志(我1(ν)/我2(ν)]。

图3。乐队由定点诱变作业。差光谱N - BR的野生型(WT)(蓝色),积极的带显示Asp85的质子化作用,消极的乐队显示Asp96的去质子化和乐队的差异显示了Asp115的氢键的变化。消极的乐队Asp96Asn Asp96消失的突变(红色)。不同的乐队Asp115Asn Asp115消失的变异(绿色)。

图4。乐队由同位素标签分配。在水解的Ras,乐队向下拉·三磷酸鸟苷状态;朝上的乐队都来自拉·GDP的状态。黑色:未标记的;绿色:γ-18O3三磷酸鸟苷。由于标签,ν的吸收作为(γ-PO3)振动已经发生了变化,而其他乐队,如ν的吸收作为(γ-PO2)振动不变。下面计算正常模式显示。

在快速扫描模式下,镜子是移动非常快。完整的干涉图我(tj在几毫秒(得到)tres)。7、8大约10 ms的时间分辨率光谱从1800到900厘米14厘米1可以获得的光谱分辨率。在step-scan模式下,9、10镜子是固定在位置Xn和时间红外强度测量(图2中绿线(b))。然后镜子搬到下一个位置Xn+ 1实验是在完全相同的条件下重复(蓝线)。测量所有的位置后,可以重新产生干涉图数据我(tj为每个时间片)。时间分辨率是探测器的上升时间的限制,通常使用液体N大约20 ns2冷却mercury-cadmium-tellurium (MCT)探测器。通过飞秒激光可以进一步提高分辨率。

带作业

为了得到信息反应,红外乐队必须分配给组织的蛋白质分子。如果蛋白质的结构模型可用,除了在信息获得。一个方法是地点的特定突变。在这里,乐队的突变氨基酸失踪与野生型相比(图3)。11

另一个选择是同位素标记的氨基酸或配体,导致吸收的光谱变化(图4)。12突变可以入侵以来,同位素标签应尽可能优先。一旦分配了一个乐队,这组非常准确的信息交互,在质子化作用,电荷分布,责任人在反应机制和债券可以获得订单。

理论的红外光谱半岛综合体育官方APP下载德甲

QM / MM(量子力学、分子力学)的方法13、14可以用来计算蛋白质的红外光谱。因为蛋白质是太大了,完全是量子化学处理的主要部分蛋白质及其周围水经典计算使用经验力场计算较低的水平,但活性中心或辅基绑定到蛋白质是被高层量子力学方法,主要是密度泛函理论(DFT)。QM / MM计算提供了频率、带宽和红外吸收强度,可与实验观察到的光谱。如果振动光谱是准确地再现,从计算结果可靠,因此更多的细节,例如,几何,电子密度和电荷分布的QM-treated蛋白部分,可以从红外光谱。这些关键参数来决定蛋白质的分子机制。

蛋白质如何质子泵

Tr-FT-IR不同光谱成立于调查lig半岛综合体育官方APP下载德甲ht-driven质子泵的细菌视紫红质(bR)(图5),泵的关键过程,质子转移的席夫碱Asp85和reprotonation Asp96 Tr-FT-IR被发现。这些发现证实了x射线结构。11

图5。(a)与时间有关的吸收变化在bR photocycle从30 ns 200 ms在4厘米1决议。使质子化的吸收Asp85(1762厘米1)和质子化了的席夫碱(公安局)(1190厘米1贴上标签。L→M反应(完成后60μs),质子转移从公安局Asp85,见衰变为1190厘米1和增加1762厘米1。(b)由于chromophor视网膜的光致异构化,水的强大H-bond 402坏了,大约一半的能量存储在蛋白质。异构化后,免费的- oh基团的悬空水401 H-bonded和不再能稳定Asp85的指控。Asp85公安局的质子转移。由于中和Asp85,运动Arg82诱导。这一运动的正电荷破坏蛋白质表面附近的质子化了的水复杂。质子化了的水集群(蓝色)商店一个质子,可能在一个Eigen-complex (H+(H2O)3]。与随机Grotthuss-proton转移在水里,水复杂的蛋白质deprotonated Arg82的定向运动。质子是稳定在第二水化壳由氨基酸代替水分子。注意,在这个数字字母代码用于氨基酸的标签(例如D = Asp, R =参数)。

生物水

蛋白结合的水分子在蛋白质结构越来越发现。我们使用bR作为一个模型系统调查这些水域的角色。15这些水分子直接参与质子传输(图5)和不仅仅是被动的元素内的蛋白质。水分子功能如酰胺侧链。这是一个范式转变。我们推测,水分子在许多蛋白质发挥关键功能的作用。在x射线结构氢原子通常不解决。因此,水簇的功能是非常不完整的信息。Tr-FT-IR可以解决质子和氢键,从而解决这些集群的功能。除了时间分辨测量,H / D交换可以进行测量以获得了所有水分子光谱的差异和酸组不同的蛋白质。16

gtpase切换机制

Ras-protein分子开关,控制细胞生长的信号。致癌突变的Ras,发现在人类肿瘤的30%,信号不能关掉。我们可以监视核苷三磷酸鸟苷的水解对GDP Ras,停止增长的信号。17在这里,我们使用caged-GTP(笼=帕拉-hydroxyphenacyl——或者昊图公司已经蛋白质绑定-nitrophenylethyl -),但不能水解。激光辐照后,形成三磷酸鸟苷和可以观察到的反应。比较三磷酸鸟苷在Ras和水,我们发现一个不寻常的转向β-phosphate收费,这是催化的一个重要因素。活化自由能的减少来自28个千卡摩尔1在水中22千卡摩尔1在Ras的减少主要是由于活化焓超过5千卡摩尔1。18

图6 (a)显示了时间的吸收带的标志。而在内在水解(蓝色)的减少Ras·三磷酸鸟苷乐队与Ras·GDP的增长是同步的乐队,在105快拉·RasGAP系统(红色)一个中间出现(绿色)。19只有在它的衰变是终端产品GDP和自由磷酸形成。中间(图6 (b))是蛋白质非共价结合H2阿宝4- - - - - -。20.这中间可以回到三磷酸鸟苷反应或者可以释放的蛋白质。在真核细胞,大约150 gtpase类似的反应机制。

图6。(一)时间分辨吸收的变化选择标记的Ras的GTPase反应(蓝色)和拉·RasGAP(红色)。蛋白质相互作用加速反应10倍5。此外,对Ras·RasGAP中间观察(绿色)。中间的结构来自tr-FT-IR测量(b)所示。20.

药物开发

几乎所有分子在红外可见。因此红外光谱可以普遍用半岛综合体育官方APP下载德甲于制药筛查。与大多数其他化验,这方法是label-free和不使用人工标记可能扭曲了药物相互作用。例如,Ras的表面变化使效应绑定可以通过tr-FT-IR来解决。21

引用

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