一个实用指南为液体样品制备chromatography-tandem质谱在临床研究和毒理学

朱迪的石头

先进的实验医学中心,美国加州大学圣地亚哥分校。电子邮件:(电子邮件保护)

液体chromatography-tandem质谱(质/ MS)是一种功能强大的技术为小分子的量化在体液,但一些样品制备前分析是必要的。有这么多的选择,选择正确的样品清理方法可为新手用户困惑。一个基本的了解样品的原则preparation-combined结构化方法选择,优化和验证一个协议可以支付股息的节省时间和更准确的和健壮的质/ MS分析。本文考察的关键因素时要考虑选择一个质/ MS样品制备策略,概述主要处理方法和协议发展提供实用的建议使用量化模型血清样本血清睾酮的化合物。

介绍

液体chromatography-tandem质谱(质/ MS)是一种行之有效的工具为小分子的识别和量化研究和工业设置,但是这项技术最近才进入医疗领域。历史上,实现挑战临床研究实验室已经开发可靠的、可再生的和具有成本效益的样品制备方法,但由于最近的技术突破,但是有的/女士正迅速成为许多小分子测试应用程序的首选技术。

为什么需要制样?

小分子分析可以执行各种临床研究中的样本类型setting-including全血、血清、血浆、尿液和脑脊液(CSF)——有三个主要原因,样品可能需要处理前质/女士。其中最简单的是除去沉淀的蛋白质和其它成分注入LC流动相时,为了避免堵塞色谱柱。消耗或删除这些矩阵列组件可以防止损坏和LC系统中的过度压力的累积。

接下来的原因是提高色谱性能。体积,pH值、有机溶剂、缓冲和水组成的液体注入色谱法LC产生深远的影响,修改LC峰形状、峰值分离和保留时间(Rt)。这些可以影响定量限制,选择性和检测的鲁棒性。为了克服这些问题,复杂biofluids通常需要兑换注射注射前解决方案兼容LC的方法。

最后,方法的精密度和准确度,以及长期稳定的质/ MS仪器响应,几乎总是消耗提高了选择性生物矩阵增加analyte-to-matrix比例。例如,磷脂是细胞膜的主要成分,存在于血清中mg毫升¹量,这可以极大地影响在样品制备方法的性能,除非耗尽。这种类型的“矩阵效应”是一个主要的约束质/ MS方法,并进一步讨论分析质量下面的部分。

样品制备的选项是什么?

应该在理想世界中,样品制备简单,成本低,允许矩阵损耗与集中分析物的选项(s)的兴趣。最常用的小分子质/ MS技术样品制备可以大致分为八类,其中每个简要下面所列和列于表1。

表1。质/样品制备女士协议的概述。

稀释

稀释或稀释和拍摄方法只涉及添加纯净水或LC病人流动相样品前质/ MS分析。这种技术被广泛用于低蛋白矩阵(如尿液或脑脊液),因为它是快速、简单和便宜。理想情况下,样本,内部标准和稀释剂直接用移液器吸取到autosampler瓶或微型板块,然后混合,离心机,直接加载到质/ MS进行自动分析。这样可以确保一个精简的工作流和最小化资源和试剂使用。

蛋白质沉淀(PPT)

蛋白质沉淀或“蛋白质暴跌”类似于稀释方法,但适用于高蛋白矩阵,如血清、血浆或全血。PPT有很多相同的特性,使稀释样品制备协议,快速、简单和便宜。样本、内部标准和沉淀剂,如乙腈和甲醇/ ZnSO₄,混合在一起,然后离心或过滤分离出上层清液注入前的沉淀蛋白质质/ MS系统。¹

液液萃取(米歇尔)

液液萃取被用于样品制备工作流多年,和涉及到分区的分析物(s)从一个水biofluid变成了水不溶混基于极性的有机溶剂。它提供了许多好处质/ MS分析,因为它允许分析物的浓度,提高灵敏度,和矩阵组件的损耗,提高选择性。不幸的是,这种多步骤的过程相对劳动密集型,需要分析物的分区(s)到有机溶剂,有机食品和水的分离层,有机溶剂的蒸发,和再造的分析物(s)的混合溶剂与LC流动相混相。

除磷脂媒体(PLR)

虽然96孔板格式过滤蛋白质沉淀商业化已经多年,过去的十年见证了过滤板的发展旨在捕捉和除去磷脂。的post-precipitation上层清液流经床上挤满了半个,例如zirconia-coated二氧化硅,保留磷脂。这提供了更大的选择性,同时保持简单的PPT协议。²

支持或solid-supported液体萃取(系统性红斑狼疮)

支持液体提取类似于米歇尔,但分区分析物的水溶液biofluid成一个非混相有机溶剂发生在颗粒床,由硅藻土或合成粒子,装进盒或96孔板。稀释biofluid正在慢慢添加到床上,就分散在一个超薄层涂料粒子。一个非混相有机溶剂将会通过媒体,导致效率高分区非极性分析物的溶剂。这种方法提供了许多的灵敏度/选择性米歇尔的优点,³而不劳动密集型和导致更一致的提取。

固相萃取(SPE)

固相萃取使用选择性固定相结合或分区的分析物(年代)。这个阶段通常需要为最佳萃取预处理,然后稀释biofluid流经固定相,它抓住了分析物(s),同时允许其他矩阵组件流浪费。几个洗步骤后,一种洗脱溶剂用于恢复被分析物(年代)。样品可能会需要洗出液蒸发和调整质/ MS分析前兼容的溶剂。

AC提取板™(ACP)

AC提取板^__(Tecan)是一个“智能”提取以同样的原则作为系统性红斑狼疮的消耗品,分区非极性分析物从水biofluids更非极性相。所不同的是,巴拿马运河管理局使用专有的聚合物,涂在板井,作为固定相。这种方法的优点是,它使用一个“吸管和动摇”协议:分析物被划分到非极性固定相,提取残渣就会被丢弃。然后,洗后一步,相对非极性洗脱剂用于分区分析物(s)回到液相。通过消除材料过程中使用的大多数系统性红斑狼疮或SPE协议,巴拿马运河管理局工作流很容易自动化。它也有能力集中分析物和消耗矩阵组件,导致增强的特异性和敏感性。⁴

在线SPE (O-SPE)

在线SPE使用LC“陷阱”column-analogous SPE墨盒或板捕获分析物而矩阵组件流浪费。流的逆转然后洗提目标分析物(s)直接到分析LC列。这种方法最大限度地减少动手时间,但需要一个更复杂的LC设置和高水平的专业知识,以确保一致的性能。

为什么投资在额外的样品清理?

表1清楚地表明,稀释和PPT是最简单和便宜的样品制备技术,虽然更复杂和/或增加的成本是必要的,有选择地集中分析物和消耗矩阵组件。分析物浓度的价值似乎明显增加敏感性但是矩阵枯竭所带来的好处是什么?有两个主要原因执行增强的样品清理;提高试验质量和提高过程的可靠性。

分析质量

大气压电离作用(API)是化学过程,将无电荷的分析物在液相离子气相中的允许检测已是不争的女士,LC洗出液中的残余矩阵组件的存在导致干扰电离作用过程在一个API。这个“矩阵效应”样品和分析物之间的不同,可能会导致量化误差。

如前所述,磷脂是一种不可接受的基体效应的主要来源在血清、血浆和全血样品。Co-eluting稳定同位素标记的内部标准(SIL-IS)可以用来有效地补偿基体效应,但共识指南和临床研究实验室认证要求往往需要详细评估方法验证期间这些矩阵的影响。^{5 - 9}例如,美国病理学家学院的检查表⁵州的平均基体效应确定来源至少有10个不同的矩阵必须小于25岁%和变异系数(相对标准偏差)由于基体效应必须小于15%或“验证研究必须包括数据来证明矩阵影响不影响测定准确性”。因此,样品制备的协议,它有效地消耗许多分析矩阵组件将是必要的。

健壮的操作

样品制备过程中消耗矩阵组件的另一个原因是保持清洁,因此,质谱仪的性能。每个注入一个生物样品中提取存款一些剩余矩阵材料质谱计的硬件,这些存款逐渐降低离子的处理。随着时间的推移,这将导致更少的离子到达检测器,灵敏度降低,直到仪器系统适用性测试失败,必须清洗。每个清洗周期(排气到大气压力,清洁的硬件和泵送回到高真空)需要24小时,导致重大损失的仪器。清洁提取物可以帮助延长免费维修间隔,导致更多的正常运行时间和更大的生产力。

有效pre-analytical样本清理还可以使仪器维护和维修更可预测的需要,理想情况下限制服务安排6个月的预防性维护。灵敏度较突然,意想不到的损失由于样品制备不足,这避免了批处理失败和计划外停机,更多样本重复的连锁效应,周转时间延迟和更高的生产成本。

值得记住的质谱仪不是唯一的组件系统,可能是退化的存在残留基质材料。过度压力由于注入阀,堵塞油管,警卫列和列可能会导致一个LC系统关闭没有完成运行,导致更多的重复测试和延迟。投资在额外的样品清理还可以帮助延长运行寿命的守卫列和列,同时提高色谱性能。

如何选择一个样品制备技术?

没有一刀切的解决方案为质/ MS样品制备。在选择最合适的为你的化验和工作流技术,考虑这些因素:

1. 分析物化学:极性(日志,日志D),电荷(pKa),热稳定性和分子量。
2. 分析物的分析物浓度:浓度或稀释(s)需要实现所需的定量下限(LLoQ) ?
3. 已知的挑战:特定的应用程序已被公认的困难,如实现适合血清类固醇激素的敏感性,足够的选择性鸦片/尿液中代谢物,或者一个健壮的协议为高通量测试如血清25-hydroxy维生素D。
4. 工作量:样本体积约束、批量大小的期望,和吞吐量和周转时间要求。
5. 实验室资源:自动和手动液体处理、经验与LC多路复用和O-SPE自动化、采矿设备的可用性(溶剂蒸发器、正压或真空抽取模块,加热块,multi-vortexers等等),专业用于样品制备在开发期间,验证和生产。

演示一个系统化的方法可以应用在实践中,考虑选择对血清睾酮的提取协议。最近出版的细节的使用机场核心计划开发一种血清睾酮分析适合妇女和婴儿标本。⁴实验室的新的工作流的关键因素是良好的精度,比自动分析和易于自动化更好的选择性。

1. 睾丸激素是一种热稳定,非极性、中性类固醇日志(P = 3.32)和分子量为288.42。提取协议工作特别好中性非极性小分子是米歇尔,系统性红斑狼疮和机场核心计划。PPT, SPE和O-SPE也是可选项,但一些警告。混合模式SPE(结合反向阶段和离子交换固定阶段)是高度选择性弱酸和弱碱性,因为极性和费用可用于分析物的保留/矩阵删除。相比之下,保留一个卸货在一个简单的非极性分析物如睾丸素C18固定相,同时试图删除矩阵非极性成分,是更具挑战性。
2. (2 & 3)需要更低的量化限制在测量睾丸激素在儿科相比,成年男性和女性患者。一个具有挑战性的1 - 5的LLoQ ng dL¹是可取的,通常需要的浓度。稀释和PLR协议不集中分析物和稀释不移除血清蛋白质。PPT协议涉及稀释,如果蒸发沉淀步骤后,将集中矩阵组件以及分析物,使其保持一个适当的LLoQ更加困难。米歇尔、系统性红斑狼疮、ACP、SPE和O-SPE更合适,一些理论对米歇尔的偏好,系统性红斑狼疮和机场核心计划。

4. 米歇尔的最低成本材料,适用于小批量,但是需要优秀的手工技术,太大工作量和劳动密集型很难自动化。O-SPE需要最小的动手时间,但内部专业知识需要保持高吞吐量O-SPE设置。系统性红斑狼疮,ACP和SPE都适合高吞吐量的应用程序在96孔板和自动化液体处理。比较易于自动化、ACP使用较少的设备(只有一个轨道瓶),不需要正压或真空歧管,系统性红斑狼疮时比SPE更少的步骤。
5. 可用的资源和专业知识通常是决定性的因素。为实验室提供内部或外部专业知识、个人偏好、经验和可用性的提取和自动化液体处理设备都将发挥作用。因此,使用米歇尔有诊断实验室,系统性红斑狼疮,SPE, O-SPE(以及最近的选项,ACP)对睾丸激素的分析。对于那些内部发展他们的专业知识,为米歇尔有广泛的文献^{10 - 13}和供应商的系统性红斑狼疮、SPE O-SPE和ACP耗材提供广泛的应用支持。ACP和系统性红斑狼疮会对大多数实验室自动化的最简单的技巧。

这个过程后,ACP被选为首选的样品制备技术,由于技术的潜力减少可变性和改善批次稳定性通过优化提取协议。结果,广泛验证方法取得了良好的精度,精度和鲁棒性。⁴

总结

样品制备是一个“必要之恶”敏感的和可再生的质/ MS分析,和还提供运营效益的仪器正常运行时间和维护调度。许多临床研究实验室正在寻求利用小分子量化质/ MS,但每个实验室都必须选择样本清理技术是最适合它的分析目标和工作负载。

对血清睾酮的例子讨论,ACP方法选择提供了一个良好的灵敏度和精度,改善选择性在现有免疫测定方法和易于自动化。⁴新开发的萃取耗材的可用性,如AC提取板,提供创新的和具有成本效益的替代传统液体或固相技术,提供实验室的潜力提高分析性能和可靠性,同时减少忙碌的实验室工作人员的负担。¹⁴

引用和注意

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14. 在这里讨论的应用程序的更多信息,联系(电子邮件保护)。

^__仅供研究。不用于诊断程序。