探索和排序单个细胞:Raman-activated细胞分选仪的应用

云,^a、c演变的歌,^bDi朱^一个Yuetong霁,^c婷婷,^c大卫•McIlvenna^dHuabing阴,^d徐剑^c和黄魏大肠^,*

^一个Kroto因为研究所,谢菲尔德大学,宽阔的车道,谢菲尔德,S3 7 hq,英国。电子邮件:(电子邮件保护)
^bWellsens生物技术有限公司,北京100044,中国的公关
^c单细胞中心、中科院重点实验室的生物燃料和山东能源重点实验室遗传学、青岛生物能源和生物处理技术研究所、中国科学院青岛,266101年,中国的公关
^d生物医学工程,工程学院,格拉斯哥大学,格拉斯哥,G12 8 lt,英国

介绍

为什么拉曼micro-spect半岛综合体育官方APP下载德甲roscopy单细胞分析的理想工具吗

一个细胞是生命的基本功能单元和所有生物从一个单细胞。而不是学习“散装”细胞,这可能平均行为的大量的细胞,研究单个细胞促进细胞生物学的深入了解,因为:(1)它有助于早期癌症诊断癌症通常是开始从单一突变细胞;(2)它促进细胞分化和发展的理解,干细胞和受精卵开始从一个单细胞分裂和专业化;(3)它分裂细胞的个性,因为单个细胞在相同的人口可能出现显著的差异由于基因表达的随机波动;(4)它揭示了微生物世界的“暗物质”,绝大多数的微生物(> 99%)有待培养。原核生物(包括真细菌和古细菌)约占全球生物质碳总量的50%¹并且我们的生物圈和生物地球化学循环的基础(例如,C和N)。²单细胞分析拉曼micro-spectroscopy绕过了培养的问题,从而半岛综合体育官方APP下载德甲揭示了那些未受教育的细菌在他们的自然环境。

单细胞研究的最常用的技术是基于荧光的检测,如荧光激活细胞分类(流式细胞仪),标签与荧光分子和细胞分离细胞根据其荧光信号。拉曼micro-spec半岛综合体育官方APP下载德甲troscopy是一种非破坏性和label-free技术能力检测和测量单个细胞的拉曼光谱(在所)。典型的在所提供一种内在的生化单个细胞的“指纹”。³在所包含丰富信息的生物分子,包括核酸,蛋白质,碳水化合物和脂肪,这使我们能够描述不同的细胞种类,生理变化和细胞表型。^{4,5,6,7,8,9,10}因此,细胞分选系统基于理想在所调查和排序单个细胞。

在所调查单个细胞

在所是和所有的生物分子光谱的一个细胞,表明细胞的表型。细胞表型、基因表达的结果,通常反映基因型。因此,不同的物种给不同的对应于他们的基因型的差异在所如果这些物种是在相同的条件下培养。在所报道区分细菌物种,甚至同一属的细菌。³

特定的分子合成的细胞会产生独特的拉曼信号从而使细胞区分。迄今为止,在所技术表明,它可以用来确定细胞综合了以下成分:油(例如,烷烃)和脂类(例如,甘油三酯(标签),特定蛋白质(例如,血红素蛋白质,金属离子),细胞色素(例如P450酶、细胞色素c)、叶绿素、发色团(例如,色素的光收获类胡萝卜素和视紫红质),有机聚合物(例如,polyhydroxyalkanoates (PHA) polyhydroxybutyrate (PHB)], hopanoids,类固醇,淀粉、硫化物、硫酸盐和一些次生代谢物(例如,维生素B12)。越来越多地进行实验测量,化合物的列表,可以通过拉曼光谱识别是不断扩展。半岛综合体育官方APP下载德甲

在所表示细胞的新陈代谢和生理状态。它能够检测细胞在不同营养条件下(例如,N损耗),生理的压力下而形成细菌孢子(dipicolinate (CaDPA)]。例如,图1(一个)显示一个工业微藻株,在所Nannochloropsissp, 96 h后nitrogen-replete和nitrogen-depleted条件下种植。在这项研究中,单一的细胞Nannochloropsissp.悬浮在水中使用波长532纳米的激光光镊捕获设置和使用相同的激发激光拉曼光谱测量后,类胡萝卜素和叶绿素在1 s漂白。之间的比较和拉曼光谱纯标记表明在所在所nitrogen-depletedNannochloropsissp. 96 h是类似于纯粹的标签,而在所nitrogen-replete细胞保持不变(见图1 (a))。这表明,氮气消耗应该引起标签积累Nannochloropsissp.和标签占较大比例的细胞在96 h。

检测化学物质有助于在所合成生物学细胞内合成。例如,图1 (b)显示一个大肠杆菌设计合成烷烃,应变相对更强烈碳氢键拉伸比野生型和碳氢键拉伸是来自细胞内的烷烃合成。碳氢键的强度比拉伸(2936厘米¹)的苯丙氨酸乐队(1005厘米¹)可用于评估的程度增强在所碳氢键的伸展。这表明,从alkane-producing细胞比例明显高于野生型细胞。在每种情况下,20个细胞被随机选择来验证结果。

探测特定碳或氮基质的细胞代谢,拉曼micro-spectroscopy可以结合稳定同位素探测(SIP)。半岛综合体育官方APP下载德甲已经表明,一些乐队在经历重大的“红移”如果在所研究的细胞成立与碳13同位素或氮15(参见图2),拉曼位移的程度成正比的比例¹³C -和¹⁵N-contents细胞。^{3,4,5,6,7,9,11,12}拉曼光谱的变化,如苯丙氨酸乐队在1005厘米¹细菌(见图2 (a)]和胸腺嘧啶乐队在747厘米¹真核细胞,可以用作生物标记¹³C-incoporation。的拉曼转变¹³C-SCRS可达到38厘米¹。拉曼位移之间的定量关系可以建立和内容¹³C-incorporation在单个细胞。与观测一致,⁶理论计算表明,苯丙氨酸和胸腺嘧啶的喇曼乐队应该转变以相同的方式在所有细胞根据¹³c含量在一个单一的细胞。它表明,一个可以定量估计¹³使用一个校准曲线c含量在未知的单个细胞。⁴Nitrogen-stable同位素探测尤其有用,因为放射性氮在本质上是不可用的。因此,在所,能够检测到¹⁵N公司在单细胞水平,为探索N代谢是有价值的(见图2 (b))。与喇曼转变¹³C-SCRS,一些强烈改变拉曼乐队(例如,那些表示在725.9厘米¹,787.2厘米¹和1577.7厘米¹)¹⁵N-SCRS推定地分配给核酸,而苯丙氨酸乐队在1005厘米¹不转变。¹²虽然变化¹⁵N-SCRS(9厘米¹)比那些不太重要¹³C-SCRS,不同的物种¹⁵N可以清楚地分类使用主成分分析(PCA)(见图2 (c))。移位的拉曼乐队在所使新陈代谢活跃细胞区别于其他社会。这一口单个细胞提供了一个活跃的细胞之间的联系和稳定同位素的新陈代谢(例如,¹³C,¹⁵N)为基质。

拉曼micro-spec半岛综合体育官方APP下载德甲troscopy还可以加上其他技术,如荧光原位杂交(鱼),使Raman-FISH测量,光学捕获技术,使Raman-tweezer研究,最近,原子力显微镜,承办tip-enhanced喇曼散射(参数)测量。所有这些组合拉曼单细胞技术的巨大潜力。

快速单细胞拉曼micro-spectroscopy系统半岛综合体育官方APP下载德甲

拉曼的一个主要缺点micro-spectroscopy自然是拉曼半岛综合体育官方APP下载德甲信号弱。¹³这阻碍了高通量单细胞拉曼技术的发展。因此,至关重要的是能够减少拉曼收购时间以达到快速筛查。最近,一个自发的单细胞拉曼光谱的采集时间减少到0.1 - -0.5年代使用优化设置,如缩短拉曼光路,采用低噪声和敏感electron-multiplying电荷耦合器件(EMCCD)拉曼信号检测,并通过增加入射激光功率。此外,共振拉曼测量可以缩短到1在所女士当细胞包含共振拉曼活性分子如类胡萝卜素。^5,14当细胞;探讨了纳米粒子如纳米银或nano-gold粒子,表面增强拉曼散射(ser)将会显著增强的拉曼信号,使快速拉曼光谱采集从单个细胞和极敏感的细胞内的单分子检测。ser可以增强拉曼信号10到14数量级。¹³

拉曼活性细胞筛选和排序

最好不要仅能观察到感兴趣的细胞通过探测细胞使用拉曼micro-spectroscopy还隔离等进一步的研究试图培养或基因组测序。半岛综合体育官方APP下载德甲拉曼镊子方法,它结合了单细胞拉曼测量和光学镊子,一直用来利用在所孤立感兴趣的细胞。¹¹然而,拉曼的吞吐量镊子技术是有限的。拉曼的集成micro-spectroscopic检测和microfluidic-based细胞排序可以实现高通量排序。拉克斯Raman-activated细胞分类的设置()与微流控设备如图3所示。细菌是通过中间通道注入设备,收敛中线的通道(图3 (b)),然后拉曼micro-spectroscopy获得他们的策略合作关系scr所检查(图3 (c))。半岛综合体育官方APP下载德甲我们最近的概念证明了这个设置可以实现Raman-activated细胞计数,计数细胞根据其在所特征。¹⁴在这种情况下,集胞藻属sp。PCC6803使用,其中包含类胡萝卜素和兴奋时产生强烈的共振拉曼光谱的波长532纳米的激光与收购1毫秒的时间(图3 (c))。从细胞包含在所¹³C-CO₂转移与细胞相比较¹²C-CO₂。

使用这种流转喇曼排序很难细胞从一个复杂的环境,土壤中细菌和病原体等相关组织,因为粒子和组织块微流体通道。Raman-activated细胞弹射(种族)开发测量和准确的细胞在所幻灯片(图4)。比赛将单细胞拉曼分析单细胞弹射激光辅助的正向传递(电梯)。在电梯中,脉冲激光主要是通过一个透明的衬底上吸光层。细胞在幻灯片上(Wellsens有限公司,中国)可以随机选择在所获得。在这些细胞中,例如,一个细胞被确认为一个¹³C-cell[图4 (a)],因为其在显示在所重大转变的苯丙氨酸乐队从1003厘米¹到967厘米¹(图4 (b))。吸收层分解在辐照材料并提供前进动力定位的光吸收和细胞此时在吸收层可以孤立和收集(图4 (c))。随后,细胞可以通过尝试种植加工或DNA / RNA扩增序列(图4 (d))。

结论

SCRS-based细胞探测和排序方法提供了一个完全新颖的方法来研究单个细胞的表型和生态生理学和探索单个细胞原位label-free和非破坏性的方式。有必要减少拉曼收购时间达到细胞快速排序。在过去的几年中,在高功率激光技术的进步和低噪声探测器(例如,EMCCD相机用于这项研究)提供机会显著增强拉曼信号。这是有可能的,在不久的将来,采集时间的次秒级水平可以大大降低在所优化拉曼系统和应用程序的共振拉曼和爵士。

探索细胞和排序基于将彻底改变我们在所研究单个细胞的角色的能力和无教养的细菌在复杂的微生物群落。它将成为一个强大的研究工具打开一个新边疆的孤立个体生活细胞试图培养和发展中单细胞“组学”技术,如单细胞基因组学,2012年设想作为一个顶尖的研究重点为下一个十年,美国能源部。¹⁵

确认

我们承认中国科技部的支持(大多数2011 im030100)。我们感谢Wellsens生物科技有限公司(中国,北京)技术支持拉克斯和种族。

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