德米特里•Gakamsky,*和安娜Gakamskyb
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荧光方法找到了一个广泛的科学和技术的重要应用。与吸收相比,荧光给很多更高的敏感性和特异性。此外,荧光具有几个重要参数,如强度,激发和发射光谱,两极分化,一生,量子产率。这些参数是溶剂性质的函数、温度、极性和粘度,可以用来研究各种系统的结构和功能,分析应用程序。例如,荧光偏振和无辐射共振能量转移用于生物标记物的检测在体外医学诊断。1
然而,使用荧光在活的有机体内诊断由有限阻碍可见光的穿透到活组织或需要使用光纤探针。同时,蛋白质是生物体的重要组成部分,应该诊断和预后的潜力。
的内在荧光蛋白是由三个与芳香氨基酸残基侧链:苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这三个,后者中扮演最重要的角色因其拥有最长的激发和发射光谱波长(近紫外范围)和最长的一生。这些特性的简化测量其荧光,允许其选择性检测。然而,相反它的普遍本质,色氨酸荧光蛋白质的主要使用仅在研究蛋白质构象的变化或蛋白质相互作用的研究。问题是否蛋白质荧光可用于医学诊断?
成功在理解蛋白质构象的作用在生物体内平衡2可以提供坚实的支持这种类型的诊断。它变得明显,蛋白质转录后修饰(天车),导致蛋白质包膜和聚合,负责范围广泛的疾病,如帕金森症和阿尔茨海默氏症产生的脑组织变性,心肌病变性引起的心脏肌肉或白内障引起的着色和聚合眼睛的晶状体蛋白质。
红边兴奋的眼睛晶状体蛋白质
这个泛型构象的基础疾病让我们设想是否可以使用蛋白质荧光检测眼透镜结构的变化。自然创造的目镜是一个完全透明的器官为荧光测量代表一个优秀的实验模型。挑战的使用色氨酸(Trp)荧光白内障诊断是非常高浓度的眼睛晶状体蛋白质(晶状体蛋白)(200 - 400 mg毫升1)使透镜的光学密度Trp吸收带的光谱范围(260 - 300 nm)一百单位。如此高的光学密度不允许激发光穿透深度超过一百微米到镜头的身体。然而,这个实验是可以克服的挑战使用所谓的红色边兴奋的;意义上激发长波长(“红”)吸收带的斜坡。3首先,由于陡峭的斜坡,光密度显著下降,317纳米波长的激发光旅行整个镜头的衰减仅约25%(图1中,左面板)。
图1所示。目镜荧光的激发正常(a)和紫外线照射过的(B)猪透镜317海里了。
第二,红色镶边激发有选择地给激发态带来一小部分的侧链坐落在极地环境中(“红移”部分)。这个分数关联错误折叠蛋白质的侧链都暴露在一个水环境,或折叠蛋白质的侧链坐落在亲水表面或“口袋”。因此,这两个特性给出了可能的组合激发整个镜头的“红移”分数。
早些时候,该方法成功地用于研究类我主要组织相容性复合体的结构和功能的蛋白质。4为了将这种方法应用于白内障诊断,我们测量可溶性晶状体蛋白的荧光激发波长的函数。发现荧光光谱表现出逐渐红移继续随着激发波长的转向红色边缘Trp吸收光谱(红移)。在符合的红色边的预测模型中,发射光谱是最大限度地转移到红色位置蛋白质溶解在8 M尿素时,这是众所周知的,有强烈变性财产。5这成功的结果鼓励我们使用整个眼透镜的方法。我们比较正常的红色边荧光和紫外线照射过的猪镜头,这是用作白内障模型。这个实验的结果如图2所示。
图2。红边兴奋的眼睛晶状体蛋白质。纠正了荧光光谱的正常和紫外线照射过的猪,镜头在90°FLS980光谱仪测量几何。激励在305 nm (A)造成红移的发射13海里和低强度的外观,额外的发射光谱带在440 nm (我440年/我Trp< 1)。而在激发在315海里(B) Trp发射峰的相对强度由27 nm转移,增加乐队增加(我440年/我Trp> 1)。
在某种程度上,这些结果与模型一致,发射光谱带的紫外线照射过的镜头,表现出更大的振幅红移。然而,有一个重要的区别:正常的发射光谱和辐照镜头显示一个意想不到的额外带红色的发射光谱的斜率。紫外线照射的振幅降低Trp发射频带,增加了额外的带的强度。这种情况似乎表明,红移分数的转换为一个新成立的荧光团与排放最大~ 440纳米。也发现440海里的比例带Trp乐队积极与辐照剂量5和这个比率计参数的敏感性远远大于裂隙灯的光散射方法的敏感性。能够使用这些额外的荧光带用于诊断目的,重要的是要理解它的化学性质。
分解:光谱分析的主要方法
质谱的辐照猪术后晶状体水溶性蛋白和水溶性的人类蛋白质样本显示,加上色氨酸残基,这些蛋白质包含两个主要产品的:hydroxytryptophan (OH-Trp)和N-formylkynurenine (NFK)和两个下游产品、犬尿氨酸(Kyn)和hydroxykynurenine (OH-Kyn)。此外,荧光精氨酸的导数,argpyrimidine (ArgP),是确定的。6重要的是,所有的荧光团可以兴奋同样的波长为317纳米,这是早期发现作为深镜头渗透和Trp权衡波长激发。
为了使这个方法半定量,我们需要正常化non-Trp发射参考信号。这个信号应不同程度相同的发射荧光多功能天车作为实验条件的函数(励磁强度、几何等等)。由于浓度的仍然几乎不变尽管修改(1 - 2%),发射的“红移”分数理想地符合这个目的。
每个荧光的光谱特性组件的知识极大地简化了计算浓度的各个组件,可以由分解总发射光谱。图3显示了一个典型的例子的光谱分解发射光谱测量术后乳化样本的二年级核白内障(数控+ +)。分解的质量由形状和振幅残差函数表明基本谱组件是正确的决定。我们发现,对于一个具有统计代表性的实验样本,OH-Trp发射,NFK ArgP总发射光谱组成的主要部分。假设铝的积累导致cataractogenesis,我们将这三个组件的累积贡献与白内障用裂隙灯的年级。6数据显示,皮尔森的相关系数为0.93。小(0.68),但仍显著,系数的相关性被发现的累积排放这些荧光修改与捐赠者的年龄17 post-mortal镜头。因此,这种方法可用于非侵入性,半定量诊断白内障,灵敏度大大增加过流技术。
图3。荧光光谱的不溶性分数乳化洪流的样品(黑色),及其分解确定从光谱识别荧光衍生品的ArgP (B)。与正常累积分数相关性白内障年级21乳化晶状体蛋白(C)。
广泛的多功能天车在晶状体蛋白被质谱,很可能所有的修改可能导致蛋白质降解。问题因此arises-why荧光分数,从所有可能的天车,与白内障的品位和年龄吗?虽然每个天车的意义不是清楚地理解,我们假定,荧光分数代表了总修改数据。此外,一些特定的荧光多功能天车已被证明在cataractogenesis扮演重要角色通过改变蛋白质的稳定性和交互。戈什et al。7表明之间的交互N终端W60和核心域二扮演了一个角色在单体的交互α-crystallinα-crystallins参与形成的低聚物的结构。α-crystallins组装成大型低聚物的复合物被认为是核心chaperone-like这种蛋白质的功能。
从Trp NFK的形成是由单线态氧的交互,因此,NFK的浓度可以用作标记的蛋白质氧化应激。此外,NFK拥有photosensitising属性,使其最重要的生态系统photo-product的因为它的形成促进过氧化氢的生产在辐照Trp解决方案。因此,NFK的形成可以刺激修改其他的侧链。
我们发现丰富的ArgPα-crystallins和形成,特别是转换的ArgP Arg120α-crystallin B可能会影响其chaperone-like函数。Vicartet al。8确定了Arg120Gly突变α-crystallin B在一个法国家庭负责desmin-related肌病。它也表明,白内障和肌病病理αB-Arg120Gly敲入小鼠的共同机制,和变异Arg120残留的人类α-crystallin chaperone-like活动造成部分损失。所有这些发现强烈建议Arg120应负的浓度与chaperone-likeα-crystallin的函数,因此可以用作标记的白内障。
总之,我们这里讨论的小说,非侵入性方法半定量测定浓度的荧光多功能天车的镜头基于同步荧光发射光谱的测量,其产品和ArgP;降解可用于诊断白内障在分子水平上。这使得该方法用于白内障评分和监控cataractogenesis超过一段时间。后者可能有助于说明cataractogenesis各种代谢和环境因素。可能在分子水平上监控镜头结构的变化也可能促进白内障药物的发展,旨在减缓cataractogenic流程和延长镜头内稳态。
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