正交光谱技术的早期可展性评价治疗性蛋白质的候选人

安妮·r·帕特里克·Garidel Karow和麦克拉薄板

勃林格殷格翰集团制药GmbH & Co .公斤,生物制药、蛋白质科学、Biberach der里斯期,德国。电子邮件:(电子邮件保护)

介绍

药物发现是一个时间要求,费力而成本密集型过程存在多种风险较高的人员流失率。为了更好地平衡不同的风险(如生物活性、绑定属性、有效性和安全性,药物动力学)遇到在早期发展阶段,使用不同的可展性的风险评估方法被引入到制药行业。这些评估应该允许增加和改善产品的正确选择和设计合适的质量属性。从中央军委的角度(CMC:化学、制造和控制)的生物制剂,除了发酵效价和净化产量、蛋白质在开发阶段的稳定性是最重要的质量属性之一,因为它直接导致产品的成本,以及产品的整体安全。除了药物产品的稳定性,发达的蛋白质在发酵过程中必须显示一个特定的稳定和/或下游加工。

然而,稳定必须指定这个词,因为它往往是不清楚的问题被认为是稳定。术语稳定总结一些稳定属性,如生物稳定性(如稳定的酶,蛋白酶),物理和胶体稳定性(构象稳定性、冷变性、表面/界面诱导变性,降水、剪切诱导变性、聚合和粒子形成)或化学稳定性(如脱酰氨基作用、碎片化、氧化、糖化、二硫化爬)。¹

在早期发展阶段,只有非常有限的稳定参数可以被认为是由于缺乏材料以及时间。除了chemical-induced稳定性分析,在大多数情况下温度是用作治疗性蛋白质的摄动参数选择稳定性质的候选人。

例如,使用差示扫描量热法(DSC)、热-诱导展开和变性蛋白质溶液的性质是监测和相应的热容曲线是注册。光谱分析基于中红外光谱和圆二色性(CD)监测蛋白质二级结构的变化的函数扰动(如温度)。半岛综合体育官方APP下载德甲^2,3

各种荧光化验(外在和内在的荧光)也可以被使用。⁴使用一个外部荧光测定。,using an external fluorescence dye that is added to the protein solution, conformational changes are monitored by probing the fluorescence dye–protein interaction. The advantage of using an extrinsic fluorescence assay is the high sensitivity towards conformational changes of the protein as well as the low material demand (< µg/experiment).⁵然而,必须意识到的荧光染料,它的存在可以直接扰乱蛋白质构象和引起构象平衡转变。集中发表文献中讨论这个问题。^4,5为了避免一种外在染料的影响,一个人可以依靠内在荧光测定,监测变化的色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸环境由于构象的蛋白质的摄动。⁶内在色氨酸荧光(ITF)测定,蛋白质消费µg范围内每实验。⁷

上述描述化验技术上的限制和不同的敏感性,最重要和经常没有反映,各种物理观察监测和必须被考虑。这意味着,实验的结果不一定匹配,因为不同的注册“变性/展开”过程。⁸

例如,ITF探测蛋白质的构象候选人是无用的,没有色氨酸的氨基酸,或DSC成为监控不足展开的蛋白质二级结构变化减少。

在本文中,我们集中在两个正交的使用技术来监测两种不同的“稳定”方面,即构象变化以及治疗性蛋白质的聚集倾向的候选人。Thermal-induced构象变化和演变由ITF监控,而Thermal-induced聚合是通过直角监控光散射(、)。这些方法和相对应的派生参数探测两种不同,正交稳定性方面。提出了化验,同时为相同的样本参数监测。在这种情况下是温度的扰动参数。

实验

材料

使用糖蛋白是由哺乳动物细胞培养技术,而non-glycosylated蛋白质获得的大肠杆菌细胞培养技术。⁹所有的蛋白质都恢复了,纯化,根据程序中描述的文学特征。^10,11蛋白质单体含量> 99%(基于高性能尺寸排阻色谱法)。

内在色氨酸荧光

ITF实验用同样的设备如前所述。⁸总之,研究蛋白质的色氨酸发射光谱被记录从310纳米到390纳米时励磁使用定义在295纳米热筛选档案从20°C到90°C。平滑后的原始光谱(七级Savitzky-Golay算法),峰值最大值的位置,表示为排放强度的比率在350海里,在330 nm, (我_350年/我_330年)是策划作为温度的函数(见图1)。结果数据平滑和过渡/展开温度得到的二阶导数。转变温度(s)描述的温度(s)色氨酸环境发生的变化由于温度升高,因此蛋白质构象变化和演变观察(T_展开。)。

直角光散射

、稳定执行筛选高灵敏度荧光光谱仪(例如PTI、光子技术国际QuantaMaster,新泽西,美国或Aminco-Bowman^®系列2发光光谱仪、热电子公司,美国WI)配有purpose-manufactured Peltier-controlled多试样夹。¹²在λ激发执行_Exc在λ= 320 nm和排放记录_新兴市场= 320海里。蛋白质浓度在0.1毫克毫升¹;样品体积大约10µL。聚合温度(T_gg)被定义为温度诱导强烈的散射信号强度增加(见图1 b),可以监测中的精度±0.5 K。图1 b的例子显示了相同的两个文化、实验的重现性蛋白的解决方案。

结果

使用ITF评估含有这种物质的蛋白质样品λ= 295 nm和305 nm之间的兴奋,这样荧光主要是排放有选择地从色氨酸和其他两个固有荧光团的贡献,酪氨酸和苯丙氨酸可以被忽视。监控的物理原因使用ITF的构象变化分析是由于排放最大的改变色氨酸的函数的极性环境氨基酸色氨酸。这极性构象变化引起的变化是可以使用热触发转移试验(见,例如,图1)。

图1所示。监测两种不同的“稳定”方面。(一)构象变化在thermal-induced展开(Tunfold)。正常化ITF蛋白质溶液的荧光强度在0.1毫克mL-1 25°C(▲(橙色))和90°C(▼[红色])。(B)、温度曲线的评价thermally-induced聚合温度(泰格)的蛋白质测定的重现性。对化验,相同的实验条件(20毫米磷酸盐缓冲剂pH值7.0,130毫米氯化钠)。1号样品(●),第二样本(○)。(美,arbitrary unit).

图1展示了温度的影响在ITF荧光光谱。色氨酸分子或多或少的无极的环境中荧光最大是在λ= 330海里的范围和增加接触的强度分量的水环境ca增加350海里。因此,强度比我_350年/我_330年用于监控构象变化和/或蛋白质结构的演变。蛋白质候选人只熊一个色氨酸,相应部分的变化/域分子的选择性地观察,而任何信息在其他分子结构的构象变化。multi-tryptophan分子ITF的解释数据变得更有挑战性,但是,允许一个获得更广泛的整体构象变化。

图2。筛选两种不同治疗性蛋白质的热稳定性(P1和P2)在同一配方(20毫米组氨酸pH值6.5;300年mOsmol公斤)。ITF的P1显示了一个过渡(Tunfold 70°C),而P2展品两种转换(Tunfold。38°C和60°C)。、观察在这两种情况下只有一个事件的发生聚合温度。在这两种情况下泰格比;Tunfold。荧光分析可见ITF在强度比I350 / I330 (Tunfold)和文化、320 nm(泰格)

图2显示了两个例子thermal-induced展开的两种不同治疗候选人。ITF的蛋白1 (P1)显示了一个转变,引起构象变化/展开,在一个定义展开开始温度(T_展开。)ca70°C,而ITF的蛋白2 (P2)看起来不同。两种转换与他们展开观察发作温度38°C和60°C。

同时两位候选人的聚合过程是通过文化、注册的。在这两种情况下只观察到的一个事件。发病聚合温度(T_gg)P1是78°C和P2 67.5°C。在这两种情况下T_gg>T_展开。

此外,在P2的情况下我们调查,第一个过渡事件是可逆的,当样本不加热超过55°C。这是确认使用DSC(数据未显示)。然而,P2的聚合时观察到的样本加热显著高于第一次ITF转变。

这个试验通常可以用于thermal-induced ITF构象和文化、聚合各种候选人的评估。

图3。温度资料的评价展开(ITF Tunfold)和聚合(文化、泰格)倾向包含各种治疗的两组不同候选人(A)和(B)在同一个解决方案制定条件(25毫米缓冲pH值6.0;300年mOsmol公斤)。(一)候选人6展品最高的构象稳定性(Tunfold)。、(泰格)遵循构象稳定性的趋势,因此T< sub> agg< / sub>比;Tunfold . .相比之下,(B)描述了具有类似Tunfold候选人。只允许对他们歧视基于他们的文化、数据。

图3显示了T_gg(、),T_展开。(ITF)六位候选人制定相同的解决方案。提出的例子中,只有一个观察ITF过渡。候选人1T_展开。(ITF)是65.3°C,而对于候选人6T_展开。(ITF)位于75.8°C。这表明基于ITF化验,候选人6展品最高的结构构象的稳定性。分析、结果六位候选人很明显,thermal-induced聚合发生构象稳定性的六位候选人匹配。最低的候选人构象稳定性评估的ITF也有最高的聚合趋势(对应于最低的T_gg)。六个调查候选人T_gg>T_展开。。为选定的候选人和基于两个稳定性指示分析的结果,候选人6最合适的CMC可展性倾向。

然而,评估并不总是直截了当。图3 b说明了五个额外的相同的正交试验分析的候选人。T_展开。五位候选人相当类似的气温在68 - 69.5°C。基于thermal-induced构象ITF化验的五位候选人或多或少是相同的。分析、(T_gg)数据,一个人可以区分候选人。最高的T_gg值观察候选人4和5(图3 b)。更仔细的调查数据显示,这两个候选人候选人5最高T_gg4显示了最高,而候选人T_展开。。的基础上,采用正交试验方法,候选人1 - 3可以丢弃,归类为“不稳定”。为了正确评估和选择最合适的候选人,其他可展性等参数绑定,功效/活动/功能等,必须考虑。然而,专注于一个分析,只有监控热——诱导构象变化不会有助于区分和选择适当的候选人。

T_展开。和T_gg为蛋白质也受溶液条件影响。赋形剂的存在,pH、离子强度可能会改变整个蛋白质的稳定性。候选人的pH值的影响如图4所示。这个候选人展览两个ITF过渡依赖于解博士ITF过渡是观察到低于50°C,另ITF过渡是观察到ca70°C。

图4。热稳定性的两个治疗候选人(A)和(B)在不同的pH值在相同的基本解决方案制定。(一)这个候选人展览两个ITF转换。ITF1受pH值的影响较大,而ITF2特性只有轻微动荡的折叠构象。在这种情况下,文化、是在一个较低的程度上受到博士(B)这个候选人展品只有一个ITF过渡(Tunfold), pH值增加从3.5到8。相比之下,文化、数据(泰格)描述一个完全相反的趋势。随着泰格pH值明显下降。泰格& lt;Tunfold。

根据结果呈现在图4中,酸性pH值条件破坏蛋白质的折叠构象。随着pH值从3.5到8日T_展开。增加。这一点尤其观察第一ITF展开。酸度范围高于6.5,thermal-induced构象并不是影响解决方案获得第一个ITF展开事件明显受到pH值的影响,然而,趋势T_展开。减少。的文化、T_gg是一定程度上受到pH值、蛋白质的趋势变得更加稳定在酸性条件。

图4 b显示了第二个例子。在这种情况下,相应的蛋白质表现出只有一个ITF过渡T_展开。从而增加从酸碱3.5到8。基础上,最合适,因此稳定酸碱条件将高于5。然而,文化、的分析T_gg数据描述了一个完全相反的趋势。随着pH值T_gg滴强烈从55°C 38°C。这个示例还演示了这个候选人是非常敏感的蛋白质聚合T_gg<T_展开。。

最后这两个例子说明,至少需要两个正交方法来正确判断和选择适当的候选人情况和解决方案。因此,挑战在于如何选择合适的化验。

结论

在早期发展阶段的正确选择合适的稳定性检查化验和与此相应的可展性属性为治疗性蛋白质的正确评估候选人是至关重要的。只关注一个展开分析肯定是不够的。必须考虑一个正交试验,这意味着化验是那些依靠不同的物理观察。的当前方法允许同时监测两个“独立”可见(T_展开。和T_gg)和蛋白质消耗很低(ca每个实验1µg)使用ITF和文化、。此外,通过评估不同治疗蛋白质的稳定pH值剖面候选人必须平衡不同的稳定方面,不仅依赖于一个稳定指示参数。

确认

Heidrun Schott,安德里亚Eiperle和迈克尔Weichel以其优秀的技术援助和Ingo承认压的批判阅读手稿。

引用

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