900 MHz的核磁共振显示了巨大的希望

Ēriks Kupie^一个和史蒂夫Smallcombe^b

^一个瓦里安公司,核磁共振仪器,28个庄园,朱丽叶,英国萨里郡KT12 2 qf,
^b瓦里安公司,核磁共振仪器,3120年汉森,帕洛阿尔托,CA 94304 - 1030,美国

50 +年核磁共振(NMR)的历史,更高的磁场总是很快通过NMR社区为他们带来了新的水平的基本核磁共振性能,即敏感性和色散。在这段时间磁场力量发展的早期质子共振时30 MHz到今天,当核磁共振光谱仪在600、750甚至800 MHz光谱仪是相当常见的。^一个这些更高的磁场让NMR科学家来解决越来越大的分子的结构,而今天核磁共振是一个正在使用的两种技术实验来确定结构的蛋白质,核酸和其他大型生物分子。(另一种技术是x射线晶体学)。

^一个核磁共振使用某些NMR-sensitive核磁共振的特性来研究样品的化学和物理性质。核磁共振光谱学家指的是氢原子的原子核与原子的重量,一个质子,当然,它是什么。

考虑到大量的新的蛋白质分子被发现的基因组学和蛋白质组学的发展,核磁共振的未来,特别是轨迹NMR,比以往任何时候都更光明。记住这些新的挑战,最近的第一个900 MHz NMR光谱由牛津仪器,瓦里安和,当然,NMR社区的欢迎。实际上,很难记住新一场强一样备受期待的900 MHz。原因是在900 MHz,不仅是基本的NMR参数将改善,但在这些相对较高的磁场强度,分子开始揭示信息的方式是特别有用的在决定大的蛋白质和其他大型生物聚合物的结构。

的第一个步骤解决任何分子的结构隔离,或分离,每个核磁共振的核磁共振共振敏感分子中原子,然后分配这些解决各种单独的原子共振。一旦每个原子在分子核磁共振敏感是核磁共振频率分配一个特征,其他核磁共振实验可以用来确定在空间各个原子之间的关系,从而使线索拓扑或分子的三维结构。¹如果几个原子的共振是重叠,可能存在一个不正确的分配,因此一个不正确的结构。这可能是特别具有挑战性的规模随着分子量的增加,即使是很小的蛋白质,它可能包含一千或更多的质子,因此质子核磁共振共振。分离这些共振使得越来越高磁场的一般来说,研究和必要的生物聚合物。

了解核磁共振在高磁场的力量,让我们首先看到增加磁场强度对频谱的影响相对较小的分子,苯丙氨酸;质子核磁共振光谱如图1所示。

图1所示。苯丙氨酸在900 MHz的质子核磁共振谱。水平轴代表的相对频率不同的核磁共振共振位置,进而揭示其化学环境。扩展显示发生的额外的色散和光谱简化随着磁场强度从500增加到900 MHz。越高磁场核磁共振光谱越分散或分居。

图1中的谱核磁共振人称为一维核磁共振光谱,在各种共振分离或解决一个频率轴。在图1中,可以看到在高磁场,NMR谱是更好的分离或分散沿着这单一频率轴。

增加磁场不仅提供了更好的光谱分辨率,而且提高了核磁共振实验的整体灵敏度大约3/2次方的磁场强度。例如,增加磁场强度在900 MHz仪器在600 MHz光谱仪相比,提高了信噪比图约84%。甚至适度增加磁场强度相比800 MHz和900 MHz仪器给出了一个利用信噪比的近20%。

可以提高信噪比进一步降低噪音水平。低温冷却探测器技术的引入^2、3可能可以提高整体的信噪比900 MHz的另一个因素四个工具。这种新技术决不是一个替代品增加磁场强度,而是一种互补的技术。

多维核磁共振

尽管维核磁共振仍扮演着重要的角色,许多核磁共振光谱通常收集和显示多个频率的函数或维度,所谓的多维核磁共振。⁴多维核磁共振的优点是核磁共振的各种共振现在可以分开沿着几个核磁共振频率轴,因此表面传播他们的飞机,例如二维核磁共振,或一个立方体,3 d NMR甚至更高的维度。

多维NMR对大分子至关重要的质子核磁共振谱即使很小的蛋白质表现出大幅重叠光谱区域。杂环的相关光谱可以帮助解决重叠的问题通过传播与一对直接相关的各种共振核,如一个NH基,在两个维度,如质子化学位移和氮化学位移。每个分子中NH债券产生一个NH“现货”相关谱。

然而,不幸的是,核磁共振敏感的碳同位素的自然丰度,¹³C和氮¹⁵N,是罕见的,这些实验在蛋白质分子发生自然相对不敏感。幸运的是,生物技术来拯救,今天,大多数蛋白质的兴趣可以“表达”和biosynthetically生长,¹³C -和¹⁵N-enriched媒体,因此生产蛋白质isotopically丰富和只包含NMR-sensitive¹³C和¹⁵N原子。⁵double-labelled蛋白质这样的使用,和实验用来分配每个骨干原子到一个特定的共振频率是一个核磁共振结构在生物聚合物的关键元素。

通过引入多维和杂环的NMR技术在1980和1990年代初,核磁共振的分辨能力大大增加,从而能够研究复杂的生物分子如蛋白质和dna。然而,光谱色散和灵敏度很大程度上仍然依赖于磁场的分辨能力。图2显示了2 d¹⁵N -¹H相关地图的101残留蛋白质获得900 MHz。在这种情况下,质子氮相关性实验选择一个实验被称为TROSY(横向弛豫优化光谱),尤其有利的900 MHz的原因将在下面解释。半岛综合体育官方APP下载德甲

图2。¹⁵N -¹H TROSY相关光谱19 kDa的蛋白质(⁶F1¹F2²F2模块纤连蛋白的凝胶绑定域名,参见参考6)记录在瓦里安统一INOVA光谱仪在900 MHz。样品的身份证坎贝尔教授j·沃纳和a·皮克,英国牛津大学。

核磁共振更大的蛋白质

作为一个越来越大的分子,不仅谱变得更加复杂和重叠,但感兴趣的核放松更迅速地在核磁共振实验中,从而扩大观察到共振线。这不仅谱线增宽增加重叠,但也严重限制相当复杂的敏感性实验需要描述doubly-labelled蛋白质当应用于大型蛋白质。因此,最近发展的到来之前下面讨论,好像约40 kDa分子量将NMR-based结构的实际限制。因为许多感兴趣的蛋白质高于实际限制,这被视为一个重大限制NMR-based结构工作。

就像核磁共振经常在过去50年里当面对什么似乎是一个重要的限制,聪明的人发现了一种方法。在这种情况下,新的实验是基于微分放松NH紧身上衣的两个组件的行为。

最重要的两个弛豫机制在蛋白质取向(DD)和化学位移各向异性(CSA), CSA项的大小是强烈依赖于磁场。干扰这两个弛豫机制产生不同的松弛率的两个组件- h紧身上衣,⁷产生一种现象被称为微分谱线增宽。自各种放松利率也取决于分子相关性*(暴跌),这种效果是放大在较大的分子。

核磁共振在苏黎世ETH的科学家们意识到,由于这两个术语是相反的迹象的组件和领域依赖性,它提出了这样的可能性,在一些“魔法领域”这两个术语可能很大程度上取消和适当的构造¹⁵N相关实验可以获得相对狭窄行,即使对蛋白质的100 kDa !⁸原来这个“魔法领域”是900 MHz,和实验,选择弛豫矩阵是TROSY狭窄的组成部分。这将打开一个全新的途径学习非常大(从核磁共振的角度)的蛋白质。

在900 MHz TROSY

图3比较两个杂环的相关光谱的小蛋白质获得900 MHz。杂环的单一量子相干(HSQC)光谱左边使用传统的技术获取NH相关性和“脱钩”任何proton-nitrogen交互,给lineshape的合成分离峰的混合物中的lineshapes夏普和广泛的组件。TROSY光谱在右边,另一方面,使用核磁共振脉冲序列优先选择只有慢慢的放松或锋利的组件¹⁵N -¹不使用脱钩H多重态。因此TROSY山峰可以比峰尖锐实验,利用解耦消除¹⁵N -¹H耦合。

图3。¹⁵N -¹H 2 d HSQC和TROSY 11 kDa蛋白质谱,YciH,公认的翻译起始因子大肠杆菌。样品由肯尼迪博士,巴特尔西北国家实验室、美国。

而TROSY提供了一些好处,同时降低了磁场强度和较小的蛋白质,它是900 MHz和1 GHz之间较大的分子或复合物,TROSY效应是最有益的。这可以从图4中的数据显示四个多重态组件从耦合HSQC光谱在500年,750和900 MHz,两个多域不同分子量的蛋白质样品。在左边的两个光谱,two-protein域复杂,微分谱线增宽的影响可以看到在900 MHz超过500 MHz,但效果不明显。然而,在右边的两个光谱,four-domain蛋白质复杂的,微分谱线增宽效应更加明显和更多的依赖。在这种情况下,即使是小得多的750和900 MHz的区别显示明显的变化微分谱线增宽。

图4。比较在微分谱线增宽的影响⁶F1¹F2和⁶F1¹F2¹F2²F1的纤连蛋白明胶绑定域的模块500,750和900 MHz。样品是由身份证坎贝尔教授j·博伊德,j·沃纳和a·皮克,英国牛津大学。

部分取向样品

轨迹的另一个非常重要的应用核磁共振测量的残余部分取向偶极耦合的样本。通常我们认为液体中的分子各向同性的暴跌或随机,没有择优取向。这是高分辨率核磁共振的基础,因为随机翻滚产生平均化学位移在所有可能的方向,和取向不同的原子核之间的耦合样本平均,离开更熟悉(液体光谱学家)标量(J)耦合条件。事情可以开始改变,然而,在非常高的磁场,分子的暴跌可能不再是各向同性的。

分子流动会受到磁场的影响,因为分子本身的磁性。例如,顺磁磁化率的蛋白质、DNA和RNA在很大程度上是各向异性,可以引起局部对齐这些分子的磁场。这样的效果是非常有趣的,因为它们包含重要的结构信息。

正如上面提到的,我们通常解释线分裂在液体中产生完全从标量(J分子暴跌)耦合速度各向同性平均偶极项为零。然而,如果磁场很强,分子排列字段可以不再被忽视。

在weakly-aligned系统中,可见残留偶极耦合的增加成正比的平方磁场,例如,来自偶极耦合更大3.24倍在900 MHz仪器相对于500 MHz系统。剩余偶极耦合由于磁场部分对齐是清晰可见的扩张- h相关光谱的顺metallo-protein细胞色素C(参见图5)。不同大小的剩余磁化率之间的偶极耦合反映角度向量和相应的氮氢键向量提供有价值的结构信息。这个信息是新出现的,主要是不同传统的参数用于结构的决心,如核能奥佛好塞效应(不)J耦合和化学变化,提供当地信息扭转角度和距离相对于其他原子附近。

图5。剩余偶极耦合观察到由于磁性分子排列para-magnetic metallo-protein细胞色素C(103残留物)含有铁^{3 +}9)(见参考。光谱被记录在瓦里安统一INOVA光谱仪在900 MHz(红色)和500 MHz。样品是由博士G.J. Pielak,美国北卡罗莱纳大学。

分子的排列可以进一步被放大通过稀释液晶媒体面向非常强烈,如bicelles和噬菌体。¹⁰使用更高程度的对齐允许更精确的测量剩余偶极耦合。不幸的是,这也会导致残留带来的实质性的谱线增宽¹H -¹H偶极耦合从而减少的有效决议。再次高场系统的分辨能力就变得非常重要。如图6所示,band-selective¹H homo-nuclear分离提供了进一步改善的分辨率和灵敏度。¹¹就像在低温冷却探测器的情况下,这不是一个选择增加磁场强度,而是一种互补的技术,可以使用在任何磁场强度来提高光谱分辨率和灵敏度。

图6。测量剩余偶极¹⁵N -¹H联轴器在101年的残留蛋白质,⁶F1¹F2模块纤连蛋白的凝胶绑定域名,溶解在稀液体结晶媒体(bicelles)。光谱被记录在900 MHz光谱(右)和没有homo-nuclear光谱(左)¹H -¹H脱钩。负峰是红色的。样品的身份证坎贝尔教授j·沃纳和a·皮克,英国牛津大学。

结论

增加磁场强度继续提高核磁共振光谱的灵敏度和分辨率。减少光谱重叠允许研究之一越来越大的蛋白质和dna等生物分子系统。此外,以极高的磁场力量新信息不容易在较低磁场可以获得和用于结构说明大型重要的生物分子,如蛋白质、dna和rna。分子在强磁场的取向效应引起的变化参数,如化学变化和耦合常数,曾经被视为独立的领域。核磁共振是进入一个新的阶段,它变成了一个非常不同的技术在这些高磁场的优点。

确认

作者要感谢j·博伊德和牛津大学的c . Redfield博士提供记录的光谱在750 MHz的频率。E.K. j·博伊德博士感谢许多鼓舞人心的讨论。

引用

1. L.E.凯通用丁香,a .伯灵顿和a . Gronenborn科学249年,411 (1990)。https://doi.org/10.1126/science.2377896
2. p .风格,N.F. Soffe, c.a斯科特,D.A.克拉格,f行,D.J.白色P.C.J.白色,j .增效。的原因。60岁,397 (1984)。
3. 西澳安德森,W.W. Brey A.L.布鲁克,b·科尔·利林,L.F.口音太重,H.D.W.山,V.Y. Kotsubo, r·纳斯特R.S.威瑟斯和w•h•王,公牛。粉剂。的原因。17日,98 (1995)。
4. E.D.P. Zuiderweg、点Petros S.W. Fesik Olejniczak和外星人,j。化学。Soc。113年,370 (1990)。https://doi.org/10.1021/ja00001a060
5. t·山崎w·李,h阿罗史密斯,湄Muhandiram L.E.凯,j。化学。Soc。116年,11655 (1994)。https://doi.org/10.1021/ja00105a005
6. 坎贝尔jr Potts和身份证,咕咕叫。当今。细胞。医学杂志。6,648 (1994)。https://doi.org/10.1016/0955 - 0674 (94) 90090 - 6
7. m .高盛j .增效。的原因。60岁,437 (1984)。
8. k . Pervushin r·里克•g .更广泛和k·伍斯里奇,Proc。国家的。美国私立高中科学94年,12366 (1997)。https://doi.org/10.1073/pnas.94.23.12366
9. A.S.拿走,d . Kakouras G.B.年轻和G.J. Pielak,生物。Inorg。化学。4,220 (1999)。https://doi.org/10.1007/s007750050307
10. n Tjandra和伯灵顿,科学278年,半岛app应用下载1111 (1997)。https://doi.org/10.1126/science.278.5340.半岛app应用下载1111
11. 漫画范德Kooi E_。Kupie, E.R.P. Zuiderweg和m . Pellecchiaj . Biomol。核磁共振15日,335 (1999)。https://doi.org/10.1023/A: 1008387305293