使用互补技术在理解铝的解毒淡水蜗牛,椎实螺属stagnalis |光谱学欧洲和世界半岛综合体育官方APP下载德甲bdapp官方下载安卓版gydF4y2Ba

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雷切尔·c·沃尔顿,凯瑟琳r . McCrohan凯斯·n·白gydF4y2Ba

生命科学学院,英国曼彻斯特大学gydF4y2Ba

不必要的微量金属在淡水系统的存在构成了风险人群的生存能力。因此水生生物生理和行为反应发展潜在的有毒微量金属,使他们能够应付这样的接触。铝(Al)是地球上最丰富的金属,是高度有毒离子的形式。的相似性在低pH值的主要网站的行动在许多水生动物鳃,它与(上皮)细胞表面相互作用导致免疫反应和粘液生产过剩。这反过来干扰吉尔功能,防止有效的氧气交换,导致缺氧。gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba尽管如此,阿尔通常被认为是相对无害的,在circum-neutral pH值通常是与氢氧化物和硅酸盐的相似性和soils-forms通常视为non-bioavailable。铝的毒性作用在低pH值通常发生在与酸性矿山废水等人为活动相关的区域和酸雨。gydF4y2Ba

艾尔很感兴趣在中性pH值来源于证据表明新鲜中和水Al水生动物是有害的。例如,相对惰性的沉淀,形成随着pH值增加,仍然导致鱼鳃刺激和毒性。gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba我们收集进一步的证据表明,在中性pH值,艾尔既积累了一系列淡水无脊椎动物和有毒,gydF4y2Ba^{3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba}包括那些不具备鳃,如大池塘蜗牛gydF4y2Ba椎实螺属stagnalisgydF4y2Ba。gydF4y2Ba这些证据表明,即使在pH7 Al可能有毒,毒性并不完全由鳃表面物理刺激引起的降水。我们随后使用一系列互补的方法来探索细胞,艾尔积累和毒性、生理和行为机制和它的最终命运。在本文中,我们讨论这些不同的技术如何提高我们理解细胞内交互涉及,利用池塘蜗牛作为模式生物。gydF4y2Ba

蜗牛的方法接触铝及其行为反应gydF4y2Ba

含有淡水蜗牛被安置在温控坦克在中性pH值,艾尔是补充道。铝水平通常对这些发现在自然淡水河的高端(250 - 500年µg LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba),接触通常会持续20到30天。坦克是清洗、水刷新和进一步增加了每两到四天;具体时间取决于实验协议和其他因素如我们是否也添加特定的配体如溶解有机碳(DOC)的水。行为评估暴露期间;通过测量响应时间喂养刺激如蔗糖、或指定一个客观的分数量化总体活动水平(见图1)。后者,个人在两分钟内观察蜗牛和给出一个分数一般活动,以及“加分”的具体行为。最大可用分数是12分。暴露于铝引起的分数在5天左右,其次是恢复在中期内即使暴露继续(见图1)。这个初始浸紧随其后复苏表明,蜗牛能够应付Al毒性在短期内,建议内部detoxificatory机制。最初蘸行为活动也表明Al可利用中性pH值,尽管艾尔的水生化学可能建议。添加其他的化学物质,如模仿医生,证明这些也显著影响铝的毒性。gydF4y2Ba

Figure 1. Behavioural State Scoring regime and illustrative data showing how Al affects the behavioural activity of L. stagnalis when compared to control animals and those exposed to Al in the presence of dissolved organic carbon (DOC).

铝的积累在软组织gydF4y2Ba

对于任何毒素发挥效果必须接触到组织或细胞,也必须在一个可用的形式,以便它可以与内部或细胞外的过程。传统上,测量微量金属的组织进行了使用原子吸收光谱(AAS)或火焰发射光谱(菲斯),根据金属的问题。半岛综合体育官方APP下载德甲这些技术的主要限制是金属的检测极限和单一元素的性质分析。这使得他们不切实际的多个金属分析或者当样本容量很小,例如,由于小组织的质量分析。电感耦合等离子体原子发射光谱法和电感耦合等离子体质谱法(icp - aes和icp)现半岛综合体育官方APP下载德甲在都越来越多地用于痕量金属研究。这些技术允许同时量化多种金属,可以低至ppt和检测范围与icp大部分金属;检测极限等非金属硅(Si)和磷(P)通常高约1磅。ICP技术有一个额外的好处的研究基地作为Si,容易与半岛,也可以量化所以允许分析金属及其潜在的配体同时没有被引入额外的错误风险通过样本分割和稀释分离分析。尽可能多的毒性机制失衡导致组织等基本金属钙、钠或钾,ICP技术同时也使这些影响进行检查。gydF4y2Ba

ICP分析准确、重现性好,小心处理样品是至关重要的。Al和Si都无处不在的环境,所以只有酸洗plasticware应该使用和超纯化学物质。经常组织通常是酸消化,然后进一步用同等体积的过氧化氢氧化前用水稀释的样本,以减少氢的浓度gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba之前的分析。样品在我们研究分析使用Jobin-Yvon JY24 icp - aes,优秀的最适条件5300双视图icp - aes或者安捷伦7500 cx icp matrix-matched多元化的标准。gydF4y2Ba

我们的研究结果表明,铝积累软组织的蜗牛,尤其是在消化腺,它是一个大型detoxificatory器官相当于脊椎动物的肝脏。消化腺贡献大约10%的总质量的蜗牛的软组织,然而经常全身负担的50%或更多(参见图2)。有趣的是,我们还证明了co-accumulation硅和铝的消化腺,2.5:1的比例,符合比率中发现水铝英石等铝硅酸盐。之前我们提出,如果一个元素没有已知的角色在高等动物,可能作为细胞内detoxificatory配体。gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba

$Figure 2. Left: Box-and-whisker plot showing the accumulation of Al in the digestive gland and remaining soft tissues of L. stagnalis from animals collected from Al-polluted sites in the wild. Right: Distribution of Al in different sub-cellular fractions in the digestive gland of L. stagnalis.$

铝解毒吗?gydF4y2Ba

蜗牛的活动的复苏在持续的暴露在Al(见图1),与铝的积累消化腺,向我们表示,半岛发生的解毒蜗牛,而不是形成无毒硅酸铝在水里。在水生无脊椎动物的毒性的两个主要机制金属可能会减少:(i)通过与金属结合蛋白如metallothioneins-heat稳定蛋白质S含量高;和/或(ii)形成的无机颗粒的金属是无害的磷酸盐等通过与配体有着紧密的联系。这些颗粒形成致密无机实体内封闭膜结合囊泡直径可达100µm使用光学显微镜,因此容易看到。金属是存储在消化腺,或通过肠道排出。gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba因此我们的调查集中在消化腺,使用两个互补approaches-sub-cellular分馏金属量化和分析显微镜紧随其后。gydF4y2Ba

亚细胞分离包括均衡的组织,然后分离不同的分数蜂窝组件的金属可能被发现。这些分数酸消化和分析金属含量使用icp - aes / MS。匀浆首先受到较少的初始速度离心分离出细胞碎片和密集的材料从其他细胞组件。这碎片是碱热处理和消化后获得致密无机部分,包括任何生成颗粒通过解毒过程。剩余的样品受到一系列的超速离心法与部队100000×步骤gydF4y2BaggydF4y2Ba,首先分离出细胞细胞器,然后,热处理后,隔离热量denaturable蛋白质。剩下的上层清液包含热稳定蛋白和小分子如柠檬酸。金属硫蛋白热稳定,大多数金属解毒研究兴趣的分数是无机分数和热稳定蛋白分数。我们的研究结果表明,而无机碎片分数一般贡献小于细胞群总数的5%,高达50%的Al消化腺的发现在这个分数,大概是颗粒。其余部分分布在其他细胞分数,与大多数与细胞核和线粒体等细胞器。这些结果暗示,如果发生Al解毒,这更可能是由于形成的无机颗粒与金属硫蛋白的相互作用。如果水平,以及其他金属,如钙、无机分数也高。然而,这种方法不能确定是否,如果和细胞内的相关联,或作为离散实体而存在相似的密度,因此仅仅是发现在相同的碎片分数。为了解决这个问题,我们使用分析显微镜。gydF4y2Ba

由于致密颗粒和其他无机实体的本质,我们的修复和嵌入方法显微镜使用硬树脂和部分使用钻石刀。部分是在光学显微镜下观察证实颗粒的存在(由形态学鉴定)前进一步超薄(~ 60海里)部分切割和安装在网格网格。Post-staining 2%醋酸双氧铀和3%柠檬酸铅用于增加对比,以帮助识别细胞的细胞器;左清白的,以防止任何进一步的部分干扰金属污渍的检测。我们把彩色部分飞利浦400透射电子显微镜(TEM)和清白的部分在一个范CM200场发射枪TEM装有UTW伊希斯能量色散x射线(EDX)分析器和Gatan GIF200电子能量损失谱仪(鳗鱼)。gydF4y2Ba

我们最初的观察表明,当颗粒与典型的形态可能是局部的彩色部分,本地化的亚细胞结构无污点的样品由于缺乏对比时可能就会出问题。由于可怜的亚细胞结构的可视化,可能能找到领域中,艾尔排泄颗粒最初被他们靠近微绒毛,分泌细胞的边缘结构。发现膜结合囊泡之后,细探针EDX被用来识别元素。扫描透射电镜(茎)edx(光斑大小大约10 nm直径)被用来获取元素的分布地图,Si, Ca, P, S和诉电子能量损失基本地图也获得Al L -和Si L-edges(见图3和图4)。gydF4y2Ba

除了Al和Si这些方法证实了高架的其他金属颗粒的存在,尤其是钙和铁。一般来说,区域的高钙不够高,反之亦然。EDX微绒毛内的领域和地区组织以外的树脂显示大量的Al和Si可以忽略不计。铝与硅密切相关,要么作为一个良好的网络,如图3所示,或者作为离散的电子致密的结构,认为颗粒。没有证据表明大量的年代(这将表明金属硫蛋白的存在)在同一颗粒。P是在低水平接近,但不像如果在同样的程度上,它还发现其他细胞。这些发现的意义,因为他们暗示如果确实有一个胞内函数的麻药的基地,这是第一个报道如果在高等动物的生物学作用。gydF4y2Ba

我们的研究提出一个例子如何利用互补的方法来检测金属在细胞和亚细胞水平,从而扩展我们对金属毒性和解毒机制的理解。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

我们要感谢博士教授乔纳森·鲍威尔和掠夺Jugdaosingh MRC-HNR,剑桥,也从工学院安迪·布朗博士,利兹大学继续我们的研究兴趣和帮助在本文获得的数据。gydF4y2Ba

引用gydF4y2Ba

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