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固体混合矩阵及其优势matrix-assisted激光解吸/电离飞行时间质谱

2016年2月1日|文章
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2016年
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固体在MALDI TOF MS混合矩阵及其优势

MarekŠebela

蛋白质生物化学和蛋白质组学、生物技术和农业研究中心地区的汉娜,理学院,深造大学,奥,捷克共和国。电子邮件:(电子邮件保护)

介绍

本评论文章描述固体混合矩阵的使用matrix-assisted激光解吸电离(MALDI) /飞行时间质谱(MS) (TOF)。这些化合物是由结合常见的矩阵和特别适用于分析多肽,蛋白质、低聚糖、寡核苷酸、脂质、合成聚合物或完整细胞。这种方法的最大优点是,它通常产生均匀样本点在目标板上,并提供高度可重复的测量伴随着增加灵敏度和分辨率。

发现1980年代末以来,MALDI,通常与一个TOF质量分析器在商业工具,已经成为一种常见的技术在生物。1MALDI-TOF女士发现其应用不仅在肽和蛋白质的分析,寡核苷酸,低聚糖,技术聚合物和小极性化合物,而且病毒甚至完整的微生物细胞。最初有一个观点,可能永远不会使用质谱分析大型生物分子。假设,首先有必要汽化,然后电离示例执行女士,将大分子分解之前他们的汽化。此外,质谱仪最初是为大众设计小分子不超过1 kDa。2

激光解吸/电离作用对生物分子是由迈克尔·卡拉斯和弗朗兹Hillenkamp引入独立(德国)固体结晶环境中3和Koichi田中(日本)在液相。4使用激光产生离子可以追溯到1960年代大多数最初的实验是用无机化合物。激光的主要作用是产生一个非常快速加热,和能量转移被认为是通过金属衬底发生。5卡拉斯和Hillenkamp实际上创造了这个词MALDI,首先认识到小的有机化合物,它强烈吸收他们使用的激光波长和表现出软电离作用,可以提高激光解吸电离过程。在分析氨基酸、高吸收功能矩阵为丙氨酸,色氨酸不吸收的氨基酸,当他们在一起的形式1:1的混合物。3后来,卡拉斯和Hillenkamp与烟酸矩阵与励磁266海里。已经知道的结果Koichi田中和他的同事,4他们成功地把他们的努力增加一个新的后加速探测器的发现可能与分子电离和检测蛋白质质量高于10 kDa。6相比之下,田中和他的同事依靠超细钴粉和甘油激光解吸电离作用和他们的满意度,他们可以测量蛋白质约35 kDa。4如今,这种方法很少使用与卡拉斯的方法相比,Hillenkamp。然而,Koichi田中被授予2002年的诺贝尔化学奖和约翰•班尼特芬一起并行谁发现了电喷雾电离(ESI),另一种软电离技术,这也是适合研究生物大分子。2

矩阵谱过程中所扮演的角色

之间的竞争这两个软电离作用电喷雾质谱技术看到推动的发展,因为它提供的优势能够耦合在线与高效液相色谱法。在1990年代,MALDI女士作为分析工具的验收提出的引入都推迟提取离子(导致高分辨率光谱)和有衰变碎片(允许一个获得结构信息选择离子)。5谱技术是实现两个步骤的过程。7首先,分析物调查通常是溶于溶剂,它包含一个适当的矩阵复合。在目标板上,一个“固溶体”存款analyte-doped矩阵晶体上形成蒸发的溶剂。因此,分子内过多的矩阵分析物分子。7在第二步中,发生在真空条件下离子源的光谱仪,co-crystals熔化在部分由强烈的激光脉冲(参见图1)。

MS-28_1-Fig.1

离子的形成的确切机制尚不完全清楚。在这一过程中肯定,矩阵是必不可少的。快速加热通过激发激光辐照引起的累积能量矩阵的分子。的材料包含矩阵和matrix-analyte集群扩展的真空离子源。8最广泛接受的主要的电离作用机制包括一代的指控物种在一个集群消融过程或气相质子转移在扩大羽photo-ionised矩阵分子。7,8气相中的离子会加速通过一个静电场,朝着分析器。

有趣的是,几乎所有的矩阵今天化合物通常使用被发现在早期的谱。51989年,导演和印度历的1月介绍肉桂酸衍生物,如sinapinic、阿魏和咖啡酸(SA)、FA、钙、respecively),9表现优异的分析蛋白质的利用紫外激光与最大波长355 nm (Nd: YAG)或337海里(氮激光)。5几年后,同样的研究人员发现,a-cyano-4-hydroxycinnamic酸(CHCA)高效MALDI-TOF MS分析多肽和糖肤的分子量范围500 - 5000。102,5-Dihydroxybenzoic酸(DHB)已成为另一个矩阵适合肽和糖肤,这是第一次检查。11目前,有许多可用的化合物可以应用为此根据特定需求,但只有少数人非常好。总之,矩阵的选择和优化样品制备MALDI实验协议是最重要的步骤。7最后的选择总是与分析物的化学性质和相应的激光波长。最有效的谱矩阵必须同时满足的一般要求:7强激光在给定波长的吸光度,崇高的能力,真空稳定,促进分析物电离作用,analyte-compatible溶剂中溶解度和缺乏反应性。矩阵的选择对分散的控制也很重要,特别是在蛋白质和多肽的情况下携带转录后修饰。少量的化合物研究了关于他们的诱导分化倾向。他们因此被列为“热”(协助内部能量高的离子的形成)或“冷淡”。例如,卡拉斯et al。发现有衰变(=亚稳碎片)降低的顺序CHCA或SA > DHB与2-hydroxy-5-methoxybenzoic混合酸(所谓的“超级DHB”) > 3-hydroxypicolinic酸(HPA)质子化了的糖蛋白。12然而,它已被证明,“热”和“冷”的分配矩阵可能反向分析物或激光能量变化。13

混合矩阵对蛋白质、肽、寡糖和寡核苷酸

已有多种方法被探索提高矩阵选择性,如使用添加剂,但他们不直接影响盐电离作用而影响co-crystallisation或排除杂质。一大潜在驻留在结合更多的化合物进入二元或三元矩阵混合物。上述“超级DHB”是DHB和2-hydroxy-5-methoxybenzoic酸的混合物的重量比9:1。这个二进制矩阵提供更高的收益率和信噪比分析物离子的高质量范围:通常适用于完整的蛋白质。形成的原因是阐明DHB晶格的障碍导致解吸“柔和”。14另一个基于DHB组合包括CHCA作为第二个矩阵组件(重量比为1:1)。15这个混合矩阵被证明是适合肽和完整的蛋白(一种改进的信号强度和分辨率特别是糖蛋白)被发现。样品的结晶CHCA / DHB导致均匀模式CHCA-derived晶体在中央部分的样本点小DHB晶体在周长。当应用,CHCA / DHB提供了显著提高spot-to-spot大规模光谱重现性和降低噪音与单独使用的组件相比,简化了完全自动化的收购。发现了一个有趣的二进制矩阵测量此处则HPA结合CHCA优化的重量比为1:1(见图2)。因此,此处则可以获得重复性良好积极的信号——或负离子模式在激光功率低于DHB(此处则一个常见的矩阵)或CHCA孤单。此外,缩短了分析时间,避免寻找所谓的“甜”的地方使用DHB时是必要的。同时,中性的磷酸基的损失(-80 Da)和磷酸(-98 Da)。混合矩阵也适用于完整的磷蛋白质(如与分子30 kDa已经证明)。16

MS-28_1-Fig.2

寡糖代表挑战MALDI-TOF女士通常有许多问题与低敏感性和强大的背景噪音。中性寡糖在正离子模式下检测钠——或者potassium-charged pseudomolecular离子DHB通常代表矩阵的选择。从母乳寡糖与大量的矩阵,研究了二元混合物和单矩阵混合物与各种添加剂。17DHB 2, 4-dinitrobenzoic酸和生理盐水稀释的解决方案被发现最优为标准分析中性化合物。5-Chloro-2-mercaptobenzothiazole被证明是一个优秀的第一层DHB和6-aza-2-thiothymine(丙氨酸;顺便说下这是适合调查在负离子模式)或酸性寡糖可以单独使用。17DHB结合基本aminopyrazine的重量比3:1允许一个优秀的数据采集不仅对中性的单糖和寡糖(包括真实的植物提取物)的内容也麦芽糊精40葡萄糖单位。18相比之下,盐的存在是不受欢迎的在执行MALDI-TOF女士之间的加合物的形成与寡核苷酸磷酸骨架的DNA和反离子(Na+K+)。如今,寡核苷酸在很大程度上是利用分子生物学基因探针。当女士MALDI-TOF合成制剂的质量评价是必要的,HPA,丙氨酸或2¢,4¢、6¢-trihydroxyacetophenone是合适的矩阵。7柠檬酸氢二铵作为常见的添加剂。一个主要障碍是相对贫穷的质量分辨率,从而增加与增加并行分子质量伴随着降低信号强度和灵敏度。应付这些麻烦,使用混合的HPA pyrazinecarboxylic酸(4:1,v / v,饱和的解决方案)被描述,它提供了更好的光谱参数以及更高的再现性杂质和宽容。19

混合矩阵为脂质、低分子量化合物,聚合物和完整的微生物细胞

蒽三酚(1 8-dihydroxy-9 10-dihydroanthracen-9-one)建议MALDI-TOF女士与脂质实验。7三元矩阵含有蒽三酚,DHB和CHCA(己烷/异丙醇/二甲亚砜;混合在一个克分子数相等的比例的碘化钠)最近被用来分析脂杂质在生物柴油,主要由脂肪酸甲基酯组成。20.三元矩阵的最大优势混合居住在更小、更均匀的形成与样本co-crystals(使用单独的矩阵)相比,对重复性和敏感性产生积极的影响。此外,半定量信息可以获得使用校准标准。同样,CHCA组成的二进制矩阵和DHB重量比为1:1在70%甲醇/组织0.1%(三氟乙酸)含1%哌啶被发现有效的磷脂质谱技术成像女士。21二元混合物放置在一片切片老鼠的脑组织,重要的是,它结晶均匀,导致增加的再现性和信号强度以及更多的信号。矩阵在其性能优于传统的矩阵,运作良好积极的——和负离子模式:100多名glycerophospholipids和鞘磷脂可以被女士和女士串联。21作为一个特定的缺点,出现了强烈的背景在质量低于500 Da,幸运的是没有打扰CHCA / DHB磷脂的使用。背景信号在低质量的问题被郭,他解决222007年:一个二进制矩阵结合CHCA和基本9-aminoacridine(化合物不同于彼此的亲和力质子)的数量显著降低背景矩阵山峰在正面和模态小分子的检测。此外,更好的带负电signal-to-background比率观察肌醇磷酸盐在复杂的植物提取物。各种二进制矩阵(例如DHB + CHCA DHB + SA, CHCA + SA和其他基于2,6-dihydroxybenzoic酸的异构体DHB)或三元混合物如DHB + CHCA + SA)或2,6-dihydroxybenzoic酸+ CHCA + SA允许一个实现一种改进的敏感性分析的聚乙二醇分子质量从1 kDa 10 kDa(原因可能驻留在更均匀基质样品co-crystal模式)。23

足总杯是一种常用的矩阵对完整细胞/孢子MALDI-TOF女士的真菌。的离子物种的数量和信号强度,足总显示是优越的,例如,CHCA, SA 2-hydroxy-5-methoxybenzoic酸或2¢4¢、6¢-trihydroxyacetophenone时镰刀菌素物种进行分析,尽管涉及添加剂或应用二进制矩阵组合如DHB / 2-hydroxy-5-methoxybenzoic酸和CHCA / DHB。24足协的一个主要缺点是co-crystals与分析物的非齐次看起来像白雪覆盖的分支。在我们的实验室,我们有一个长期和广泛的经验,使用二进制矩阵进行完整的真菌。找到最优矩阵,CA, CHCA DHB + FA逐个进行评估,然后还各种二元混合物的形式如CHCA / FA, CHCA / SA和FA / SA(不同的混合比例和溶剂)。FA的混合物和SA的重量比1:3毫升(特别是5:15毫克1)乙腈/ 2.5% (v / v)组织,7:3,v / v,终于被证明是最优处理真菌和卵菌纲。25它允许复制采集的信号(因为均匀的结晶模式)与相对较高的信噪比,这是均匀分布于大质量区域(参见图3)。还一个二进制混合CA / SA)或三元混合物与钙、FA和SA代表好选择使用真菌细胞(未发表的结果)。

MS-28_1-Fig.3

结论

样品的制备MALDI-TOF女士是一个令人兴奋的化学实验。选择最好的矩阵,溶剂和样品制备技术是至关重要的步骤实现可靠的结果。克服某些缺陷矩阵常见化合物的使用,有可能应用添加剂或二元或三元矩阵系统。结合更多的化合物进入最后一个混合允许优化所需的不同的属性矩阵的不同身份和/或浓度的组件。因此,样品制备步骤提供更均匀的结晶在目标板上,保证了高重现性的测量,通常是伴随着更高的灵敏度和更好的解决信号。

确认

这项工作是支持的批准号L01204从教育部、青年和体育,捷克共和国(国家项目的可持续性)。

引用

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