直角光散射蛋白质耐热性筛选:从研究到开发

帕特里克Garidel

勃林格殷格翰集团制药GmbH & Co . KG、流程科学、蛋白质科学、d - 88397 Biberach der里斯期,德国。电子邮件:(电子邮件保护)

介绍

在过去三十年的生物制剂开发并成功商业化由于其高疗效和福利。这些成就主要是由重组DNA和蛋白质的令人印象深刻的进步科学技术。生物制剂是复杂的分子实体通过生物技术生产过程使用哺乳动物或细菌细胞培养技术。^1,2最常见的类生物制剂是单克隆抗体,而其他生物制剂属于干扰素治疗的家庭,或者是胰岛素或胰岛素样实体与衍生品或纤溶酶原激活物蛋白质,仅举几个例子。

相比古典新化学实体(道理),生物制剂稳定性方面更敏感,由于他们的大分子量和大小,但也由于其复杂的三维结构,主要决定了生物活性。^3,4非常小的三维结构的变化可能会强烈影响生物活性。除了化学不稳定性,如de-amidation、氧化、异构化的某些氨基酸、水解、二硫化匆忙或糖化,物理和胶体不稳定,如蛋白质变性或形成的内在和外在蛋白颗粒的高相关性由于潜在的免疫原性的蛋白质聚合。^4,5除了这些挑战,这个过程本身可以产生大影响蛋白质的质量和完整性。

生物制剂的开发过程中,各种克隆选择候选人筛选和基于质量属性。在论文中,细胞活力、细胞密度、遗传稳定性或细胞生产力是重要的参数。此外,表达治疗性蛋白质必须尽可能分析特征除了确定其稳定性。一个主要的挑战是极少量的蛋白质可以在早期研发阶段的调查这些选择参数。

调查和屏幕在溶液中蛋白质的稳定性,使用各种生物物理方法,它依赖于监控稳定性指示参数。最常见的方法是量热法,荧光光谱(intrinisic或外在),红外光谱和圆二色性。半岛综合体育官方APP下载德甲^6,7,8

压力应用于蛋白质的解决方案是,在大多数情况下,一个特定的温度扫描,从而监测构象和热稳定性,这第一个近似是整体长期稳定性相关。有提到,在这种thermal-induced,快速稳定筛选实验,化学退化,如de-amidation或氧化不直接监控或考虑。因此,只有一个特定的视图被认为是稳定的,即热稳定性。⁹

取决于所使用的技术,注册稳定性指示参数是完全不同的,因此监测蛋白质热稳定性和温度引起的不同方面展开。例如,在量热实验,热容曲线是注册,显示各种贡献在向左反应蛋白质展开,而使用红外光谱监测二级结构的变化。半岛综合体育官方APP下载德甲更多详细信息见参考资料。^6,10然而,并不是每一种方法可以应用在早期研发阶段由于技术的限制以及缺乏可用的材料稳定性筛选。在上述提到的方法中,荧光光谱是肯定的方法选择非常少量的材料是可用的。半岛综合体育官方APP下载德甲通常,荧光实验执行内在或外在荧光耐热性筛选。使用外部荧光染料通常疏水,必须警惕可能会dye-protein交互可能导致部分蛋白质变性。在这种情况下,这是一个问题,内在荧光光谱是更适当的和可靠的,尤其是蛋白质中含较多的色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸(见下文)。半岛综合体育官方APP下载德甲

然而,使用相同的荧光设备,也可以执行另一个热稳定性指示分析,即直角光散射(、),这是一个label-free方法。

本文描述的方法并给出例子如何使用这种分析在早期蛋白质科学研究和开发阶段。

实验

材料

用单克隆抗体(mAb)是由哺乳动物细胞培养技术和单链抗体(SCA)片段大肠杆菌细胞培养技术。¹蛋白质被恢复,纯化,根据程序中描述的文学特征。^1,2,6,11蛋白质单体含量> 99%(基于高性能尺寸排阻色谱法测量)。

直角光散射(、)

标准荧光光谱仪、稳定进行筛选(例如,PTI发光QuantaMaster光谱仪、光子技术国际福特、英国)配备了自制,peltier-controlled多试样夹持器。在λ激发执行_Exc在λ= 320 nm和排放记录_新兴市场= 320海里。

内在色氨酸荧光(ITF)

ITF实验用同样的设备如前所述。¹²

结果

使用设置,固有荧光(如果)和文化、监控同时在同一实验。ITF(内在色氨酸荧光)λ_Exc= 295 nm和排放λ之间的记录_新兴市场= 300 nm和400 nm)最近所描述。¹²然而,文化、测定使用的激发和发射波长320 nm,由探测器记录为90°。在稳定筛选实验,蛋白质溶液温度增加从20°C到90°C温度使用特定的协议。

如果可能的环境措施和/或结构变化等特定氨基酸色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸(取决于λ_Exc)。¹³色氨酸作为荧光团的使用是基于它的发射是高度依赖于荧光团的极性环境。因此ITF,潜在的色氨酸环境的改变引起的应激构象变化是监测和策划作为温度的函数等强度比率350/330(更多细节见引用的引用12和13)。

、试验是用来检测和监控的微妙变化关联的行为强调蛋白质否则视觉清晰的解决方案。、能够调查通常可溶性蛋白质分子过渡到宏观变化的形成不溶性蛋白质颗粒。

图1显示的示例监视、测量作为温度的函数。一般来说,一个观察,在一个特定的温度、信号强度迅速增加。这是有关thermal-induced不稳定的蛋白质在溶液中由于蛋白质的关联属性,其次是可能形成更大的颗粒,形成蛋白质的演变。六、数据实验图1中给出了两个样品的。为样本(A) - (C),一个相对突然的转变在61°C。这个温度设置聚合温度(T_gg)。不同的方法可以用于这个温度的定义,例如温度的测定曲线突然增加和树叶基线(发作),或s形曲线的拐点可以确定和使用。独立的方法,比较研究,必须使用相同的评估过程。的例子,两个数据评估方法导致非常相似的结果(见图1)。

中观察到的过渡、实验表明某种类型的协会的形成现象,温度应力引起的。在某些情况下,结束时温度剖面,蛋白质样本可能形成白色絮状沉淀。inter-sample再现性的例子是图1所示,即三个独立的调查样本为同一溶液条件(样本1 a、1 b和c、T_gg= 74°C + / - 0.2°C)以及相同的样本的调查的一个例子(intra-sample),然而,三个独立的、实验(AA、AB和交流,T_gg= 61°C + / - 0.3°C)(备注:样品1和样品的pH值的解决方案是不同的)。这两个例子显示一个高重现性的thermal-induced稳定筛选试验。

荧光技术方法有一些优势在量热法等其他方法筛选thermal-induced稳定。¹⁴量热实验,通常ca1毫克的蛋白质是一个实验所需。与相同数量的蛋白质,这取决于使用的设置,可以执行大约100荧光实验,即大约100个不同的解决方案的条件可以调查。此外,由于荧光技术方法的高灵敏度和极低的所需的材料,这些方法非常适合于热稳定性评估在早期研究开发阶段。

例如,在早期发展阶段各种克隆评估和排名。克隆评估关于各种参数,例如,克隆的生产力,以及蛋白质的特征表达蛋白质,例如,绑定能力。然而,其他蛋白质等参数glyco概要(glyco蛋白质)、溶解性、热力学稳定或聚合的倾向也被评估。例如,图2显示了一系列的单克隆抗体(mAb),ca150 kD)候选人,或多或少相同的绑定能力。因此,在此基础上评价参数,不同的克隆非常相似,然而,文化、分析清楚地表明,他们的热稳定性是研究克隆候选人截然不同的相同的溶液条件下(图2)。热稳定性最高,即最高T_gg,发现克隆候选人1、5和7T_gg在76°C和78°C之间。此外,还观察到,克隆候选人3显示了一个高浊度与其他候选人相比,提出的解决方案。

以及耐热性筛选候选人,克隆、也适合在下游和制定发展评估解决方案的条件。例如,图3(一个)显示离子强度的影响(氯化钠)T_gg单链抗体(SCA,ca30 kD)片段。15毫米的基本配方由醋酸缓冲pH值5.5和各种大量的氯化钠从0 mM到500 mM。仔细检查、曲线表明,增加的盐,T_gg增加。这表明盐的存在引起蛋白质结构构象的“稳定”,因此,T_gg从54(0毫米氯化钠)增加到63°C(75毫米氯化钠)(图3 (b))。然而,随着氯化钠盐浓度超过75毫米,T_gg减少和500毫米氯化钠盐浓度高,T_gg显示了其最低。此外,在这个高盐浓度高浊度也在观察,表明低蛋白质溶解度和高倾向蛋白质颗粒的形成。

这个分析也可以用于迭代评估制定发展计划赋形剂对蛋白质的稳定性。多试样支架的使用允许大量的样品被测试在“并行”。目前开发的仪器,使用、方法,允许调查近50个样品在4 h。升温速率的变化,实验时间可以进一步优化。

结论

在label-free生物物理分析调查在溶液中蛋白质的热稳定性,文化、价值的替代方法量热法或振动光谱。半岛综合体育官方APP下载德甲运行、实验的一个好处在于,它可以运行在一个典型的荧光计,根据仪器设置,即使在平行于内在的荧光光谱。半岛综合体育官方APP下载德甲荧光技术方法的主要优点,以及文化、,每样蛋白质所需的绝对数量在几微克的范围。

然而,重要的是要指出,各种可用的生物物理蛋白质筛选方法依赖于监控不同的物理变性参数(请参阅前面的讨论)。因此,观察到的变性温度,物理和生物化学的原因,不同。¹⁴此外,根据试验使用,不同的演变过程是观察和监控。这以是一个直接比较的、和ITF实验相同的样本(图4)。在ITF实验中,色氨酸被监控的极性环境的变化。ITF分析显示两种转换;一个位于ca50°C和第二个70°C(图4)。额外的实验表明,第一个转变是可逆(数据未显示)。然而,在文化、实验中,T_gg观察到73°C,监控一个关联的蛋白质性质的过程,在大多数情况下,是不可逆的。

这些数据的比较分析是非常有用的理解在溶液中蛋白质的稳定机制的函数,例如,添加辅料,为了开发一个合理稳定的策略。

确认

英奇霍尔,Beate费舍尔Heidrun Schott和迈克尔Fath以其优秀的技术援助和乔伊Studts承认的批判阅读手稿。

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