细胞培养中蛋白质浓度预测:下一阶段在近红外生物过程分析

托德斯特罗瑟

美国热费希尔科学、麦迪逊、WI

介绍

生物生产材料在许多工业过程中一个越来越重要的方面包括相关药品、食品、诊断和燃料。大多数这些生物制剂在发酵罐和生物反应器生产专门的细胞培养生长和感兴趣的分子形式。被用在许多不同类型的细胞培养和生物制药产品的生产包括转基因细菌和酵母细胞。然而,大多数的产品都是蛋白质培养哺乳动物系统,如中国仓鼠卵巢(CHO),绿猴(州立)或人类胚胎肾细胞系(HEK)。很多这些产品的大型复杂的蛋白质,激素或多糖不可能或很难在大量生产以任何其他方式。最近的一项调查,美国食品和药物管理局指出,有超过350的生物制剂批准各种使用包括疫苗和诊断和治疗重要的抗体。

蛋白质含量是一个重要的参数在确定细胞培养的成功和质量在制造一个可行的最终产品。本文评估能力的傅里叶变换近红外(FT-NIR)光谱过程分析仪来预测生物相关的蛋白质浓度动态的细胞培养。半岛综合体育官方APP下载德甲蛋白质浓度使用CHO细胞培养进行分析。过程的细胞培养样本扫描分析仪transflection探针耦合。最优化的分析样本光谱然后进行使用偏最小二乘(PLS)方法。实验结果证明,请分析蛋白质的浓度在不同细胞培养样本提供优秀的预测能力的范围内材料测试,与蛋白质浓度在0.16 g L¹和5.0 g L¹,误差小于0.5 g L¹。可行性研究显示,一个FT-NIR分析器可以正确地预测靶蛋白浓度在生活和动态的细胞培养。

生物处理的挑战

就其本质而言,生物工艺生产所需材料依靠复杂的生物系统合成有用的产品。虽然典型的化学生产过程有相对较少的可变性,生物系统固有的复杂性使得大量的批次的变化不可避免的。由于过程的复杂性和可变性,据估计,30%的生产批次需要再加工质量原因,导致一个10倍的利润损失。生物过程的关键制造商试图让一个一致的产品限制可变性。这需要严密控制生物反应器的操作,进而需要信息的过程发生在生物反应器通过分析和跟踪。

行业依赖于复杂的生物系统受益匪浅密切关注他们的细胞培养的生长和生产的目标分子。通过监测和控制细胞培养条件下,生物处理厂商有机会分析批次更快和更经常导致改进目标蛋白的生产。监测蛋白质生产的一个关键方法确定细胞培养正常运作,最终的结果将是预期的产品。然而,蛋白质很难分析在生物反应器主要是因为浓度一般较低。它也可以挑战区分目标蛋白质和其他细胞产生的蛋白质。因为靶蛋白需要经过一定的修改步骤,重要的是要明确识别的蛋白质产生的目的是为最终的产品。

手册的方法监测生物工艺要求技术人员干扰的过程去除样本,分析它们在一个单独的实验室。这些手工方法需要大量的时间和资源专用为了完成分析。生物生产过程的本质要求高吞吐量和经济可行的技术。因此,生物产品制造商不断地寻找改进的测量技术,可以成功地实现生产水平。在生物处理过程分析技术(PAT)举措提高整体产品质量和减少浪费减少这个过程的固有的可变性和会计。¹近红外光谱分析和质量控制的这些行动的一个关键部分。半岛综合体育官方APP下载德甲

近红外光谱技术的力量半岛综合体育官方APP下载德甲

近红外光半岛综合体育官方APP下载德甲谱法已被证明是一个简单而可靠的技术质量控制和生产过程的动态测量,包括生物处理应用程序。²近红外光谱技术的主要优点包括光谱采样和速度的轻松半岛综合体育官方APP下载德甲获得分析结果,这两个过程的提供更好的控制。例如,一个FT-NIR过程分析仪能够带一个在线样品每10年代,相对于其他技术,通常每天处理一个样本。这个强大的技术提供了大量的时间和成本节约潜力巨大,提高产量和降低失败或重新加工批次的数量。

近红外光半岛综合体育官方APP下载德甲谱利用光12820厘米之间¹和4000厘米¹(780 - 2500 nm)来确定身份和各种材料的数量。在这个地区最感兴趣的有机分子吸收光线通过组合或泛音振动。这些吸收带进行光谱分析的优点是,光线可以穿透更深入分析下的材料,不需要稀释或操作的示例。因此,近红外光谱分析器可以直接耦合到一个过程流或坦克,光谱分析可以执行而无需人工干预;³近红外光半岛综合体育官方APP下载德甲谱可以自动分析和实时结果而不需要取样品。

以前的工作进行细胞培养使用近红外光谱通常集中在监测和控制营养物质,废物,细胞密度和其他参数相关的健康细半岛综合体育官方APP下载德甲胞培养。^4,5,6虽然这些参数用于确定细胞的相对健康文化,感兴趣的更重要的参数是实际的生产和目标分子的浓度。很少近红外光谱研究确定和测量在实际的细胞培养条件下蛋白质浓度。多变量最优化算法的进步与改善仪器开放可能延长蛋白质含量近红外光谱预测能力的细胞培养。半岛综合体育官方APP下载德甲在本文中,使用一个FT-NIR过程的可行性分析器来预测蛋白质浓度在动态细胞培养是生物相关的浓度。

方法

CHO细胞培养在最佳生长条件,直到细胞浓度达到大约一百万个每毫升。这是一个典型的细胞密度对于一个年轻的和不断增长的文化。样品的细胞培养新星BioProfile进行测试^®分析器(新星生物医学,沃尔瑟姆,妈,美国)来确定浓度的葡萄糖、谷氨酸盐、乳酸和氨。这些材料的浓度变化在整个实验过程中,占一些变化可能会遇到跨文化。飙升的浓度不同,异常改变的样品与营养废物或稀释样品的细胞培养。这四个组件的每个改变这两个或三个不同浓度表示。表1列出了各种养分浓度范围,浪费了样品和蛋白质的组成部分。这种方法也有去除效果的不同组件之间的协方差和蛋白质。超纯牛白蛋白蛋白质添加到解决方案来表示目标蛋白质合成的细胞。

表1。浓度范围的各种组件。超过35所代表的解决方案不同的蛋白质浓度也不同浓度的营养物质和废物的组件。

转基因细胞培养大量设计生产目标蛋白几乎所有其他细胞蛋白质。因此,蛋白质浓度在细胞培养媒体经常会方法和超过5.0 g L¹并几乎完全由目标分子。白蛋白蛋白质重组蛋白,因为它是一个很好的模拟是在极其纯粹的形式和包含NIR光谱积极组织本质上相同的一个典型的目标蛋白质从细胞培养。在这种情况下,纯度是极其重要的,因为任何无关的材料现在还将有近红外光谱信号,会导致混淆的结果。白蛋白蛋白质材料仔细权衡和添加到细胞培养浓度从0.16 g L¹5.0 g L¹。35岁以上不同的解决方案,生产一系列营养和浪费以及蛋白质浓度。这些不同的解决方案,都导致了54光谱用于构建最优化方法和20个光谱被用来验证方法。

的细胞培养样本扫描热科学Antaris MX过程分析仪(美国热费希尔科学、麦迪逊、WI) 10000厘米之间¹和4000厘米¹。分析器是耦合transflection探针可调节通路长度。距离的差距将总路径长2.5毫米1.25毫米。16个扫描是平均每频谱和收集使用8厘米¹决议。样品时间需要大约15 s。两个光谱每个样本收集。图1显示的图像探测器前插入一个细胞培养在光谱采集样本。样品光谱被加载到热科学TQ分析软件(热费希尔科学)最优化分析方法使用请与一个常数通路长度。一阶导数光谱分析的模式使用诺里斯平滑滤波器。两个地区被用于分析:8910 - 5340厘米¹和4830 - 4340厘米¹。这两个区域跨广泛的收集信息数据,同时避免完全衰减水峰围绕5100厘米¹。图2显示了代表原始光谱和一阶导数光谱的样品。

结果

偏最小二乘分析蛋白质浓度的各种细胞培养样本显示良好的预测能力范围内的材料测试。54光谱用于开发请法在标定图(图3)所示,比较了计算蛋白质浓度与实际的浓度。校准图可用于确定如何方法预测蛋白质浓度的样品。情节发展的最优化方法导致的相关系数为0.977。均方根误差的校准(RMSEC)为0.33 g L¹和预测的均方根误差(RMSEP从20)计算验证样本为0.31 g L¹。此外,交叉验证的均方根误差(RMSECV)为0.51 g L¹。这些错误表明,蛋白质浓度在细胞培养样本可以预测0.5 g L¹或更少。大约1⁄3的这个错误是由于用来权衡平衡蛋白质材料。

结论

这个可行性研究显示了一个FT-NIR光谱分析器可以正确地预测靶蛋白浓度在生活和动态的细胞培养。该技术成功地展示了能够测量和实时监测蛋白质浓度相关的浓度。开发的方法显示了良好的相关性与蛋白质浓度在0.16 g L¹和5.0 g L¹,误差小于0.5 g L¹。这个应用程序演示了的持续能力FT-NIR光谱系统成功应用于生物处理环境中它可以安全地,准确、自动监测、控制和预测目标蛋白质浓度在细胞培养。

因为近红外光谱学是一个实半岛综合体育官方APP下载德甲时和自动分析生物材料的非侵入性技术,可能使用生物反应器生物制药公司提供了广阔的前景。近红外光半岛综合体育官方APP下载德甲谱学提供长期校准稳定性以及通用性,使其在生产环境中相对容易实现。实时过程控制的生物制剂是可取的生物工艺制造的世界,和近红外光谱技术是一种快速、非破坏性技术,适用于在这个上下文。半岛综合体育官方APP下载德甲实现最优生产条件要求测量的因素影响生物过程的性能。对于过程控制应用程序,这将是在线和实时发生,这样可以采取适当的控制或补救行动。近红外光半岛综合体育官方APP下载德甲谱有潜力成为满足这种需求的常用生物工艺制造业通过提高行业质量控制程序的功能。先前的研究已经表明,近红外光谱可以监视细胞培养条件促进优化蛋白的生产。半岛综合体育官方APP下载德甲现在这种技术可以扩展到监视和预测蛋白质浓度。

近红外光半岛综合体育官方APP下载德甲谱学提供潜在的生物工艺制造企业限制生物生产过程中的可变性,从而增加产量和减少错误。因此,制造商可以减少返工批次或相关的时间和成本确定批失败。近红外光半岛综合体育官方APP下载德甲谱还提供了数据提取的难易程度以及优势的速度获得分析结果,这两个过程的提供更好的控制。这消除了需要手动的方法监测生物处理,要求技术人员让生物反应器持续到预期的时间表,然后测试质量保证,或干扰的过程拿出样品和分析它们在一个单独的实验室。减少人工分析方法的需求也减少了时间和成本与质量控制相关的过程。添加功能来预测蛋白质含量作为生物处理制造商的帕特倡议具有巨大的潜力,提高细胞培养的成功率和质量在发展一个可行的最终产品。

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